辛 玥，宋萧萧，王玉箫，聂少平，殷军艺
（食品科学与技术国家重点实验室，中国-加拿大食品学与技术联合实验室（南昌），江西省生物活性多糖重点实验室，南昌大学，江西 南昌 330047）
豇豆（）又称带豆、饭豆、腰豆和长豆，是我国主要食用杂豆之一，主要营养成分包括淀粉（50%～65%）、蛋白质（18%～35%）、非淀粉多糖（后续简称多糖）（1.43%～5.37%）、酚类（1.44～5.59 mg/g）等。大量研究表明，豇豆具有抗氧化、降血脂、辅助治疗心血管疾病等功能。虽然豇豆的蛋白质及酚类的研究相对较多，但作为豇豆主要活性成分之一的多糖研究报道相对较少。
杂豆主要由子叶和种皮构成，子叶多糖和种皮多糖在结构和生物活性上存在较大差异。鹰嘴豆种皮多糖主要由甘露糖（mannose，Man）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、木糖（xylose，Xyl）和阿拉伯糖（arabinose，Ara）组成，物质的量百分比分别为2.16%、2.96%、42.17%、9.87%、23.15%、6.29%和13.38%，具有增强机体免疫活性、体外抗氧化等生物活性；而鹰嘴豆子叶多糖主要由Glc（40.0%～45.15%）、Gal（0.6%～0.9%）、Ara（2.6%～3.4%）组成，具有缓解高血压等作用。上述报道显示，鹰嘴豆子叶和种皮多糖在结构和功能活性上存在较大的差异。现有研究也表明，黑豆不同部位来源多糖同样在结构和功能上存在差异性，如黑豆种皮多糖为半乳甘露聚糖，分子质量为7.55×10Da，可抑制胃癌细胞的生长，子叶多糖则主要由Ara、Rha、Gal、Glc和Man组成，分子质量为1.95×10Da，则在抗氧化方面具有较好的作用。
目前，豇豆多糖相关研究与报道主要集中于全豆，如Tharanathan发现豇豆全豆多糖的单糖组成以Ara、Xyl为主，除此之外还含有少量的Rha、Man、Gal、Glc。Wu Guangjie等报道了豇豆全豆多糖的单糖组成以Gal、Glc为主，且以分子质量100 kDa和24 kDa的组分为主。因此，需要进一步关注豇豆不同部位来源多糖结构和生物活性的差异性。
本研究以豇豆为原料，分别对全豆、子叶、种皮多糖进行分离纯化，并对其结构特征及抗氧化性进行比较，相关结果将为豇豆副产物的高值化应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
豇豆（肾形豆），购于陕西省米脂县。
JK008大孔树脂 北京科海思科技有限公司；考马斯亮蓝G-250 美国Fluka公司；牛血清蛋白 美国Amersco公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-amino-di(3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt，ABTS）、抗坏血酸VC、超氧阴离子自由基清除能力检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒（铁离子还原能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP）法）上海碧云天生物技术有限公司；Ara、Glc、岩藻糖（fucose，Fuc）、Gal、Rha、GalA 美国Sigma公司；葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Xyl、Man 北京百灵威科技有限公司；透析袋（截留分子质量8～14 kDa）上海源叶生物科技有限公司；氯化钠、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢、过硫酸钾、乙醇、苯酚、咔唑、浓硫酸等均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Dionex ICS 5000离子色谱仪 美国Thermo Scientific公司；Nicolet 5700傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo公司；e2695高效液相色谱仪 美国Waters公司；T9双光束紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Labconco 12L冷冻干燥机 美国Labconco公司；EYELA SB-1100旋转蒸发仪 日本东京理化器械株式会社；ANKE DL-5C离心机 上海安亭分析仪器有限责任公司；AL-104电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 多糖的分离纯化
1.3.1.1 多糖提取
采用热水浸提法提取豇豆多糖。将豇豆全豆、子叶、种皮分别粉碎过筛后，80%乙醇溶液浸泡24 h，挥干乙醇，再以料液比1∶10（g/mL）将醇不溶物于95C水浴中提取4 h，离心（5 000 r/min，10 min）收集滤液，分别加入淀粉酶（95 ℃，90 min）、木瓜蛋白酶（60 ℃，30 min）、糖化酶（pH 4.5，60 ℃，30 min）进行酶解，在100 ℃灭酶10 min，离心（8 000 r/min，10 min），上清液于透析袋（截留分子质量8 000～14 000 Da）中透析2 d，然后加入一定体积无水乙醇至溶液中乙醇含量为80%，所得沉淀经溶解后再进行冷冻干燥，分别得到豇豆全豆粗多糖、子叶粗多糖、种皮粗多糖。
1.3.1.2 多糖的纯化
分别用NaOH、NaCl、HCl溶液将树脂活化，将上一步得到的3 种粗多糖分别配制成60 mg/mL的溶液，离心（8 000 r/min，15 min）后上样，用去离子水冲洗3 倍柱体积，收集洗脱液浓缩至一定体积，加入无水乙醇至溶液中乙醇体积分数为80%，离心后将醇沉沉淀复溶，复溶液冻干得到豇豆全豆多糖（polysaccharide，VUP）、子叶多糖（cotyledon polysaccharide，VUCP）、种皮多糖（hull polysaccharide，VUHP）（图1）。
图1 豇豆全豆、子叶和种皮来源多糖提取制备流程示意图Fig. 1 Flow chart for isolation of polysaccharides from whole seed,cotyledon and hull of cowpea
1.3.2 基本结构
1.3.2.1 化学组成的测定
以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定多糖中中性糖含量；以半乳糖醛酸为标准品，采用咔唑-硫酸法测定多糖中酸性糖含量；以牛血清白蛋白为标准品，采用考马斯亮蓝法测定多糖中蛋白质含量；以没食子酸为标准品，采用福林-酚法测定多糖中总酚含量。
1.3.2.2 分子质量分布的测定
参考Wang Yuxiao等方法，采用高效凝胶渗透色谱（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法对多糖分子质量分布进行测定。色谱条件：UltrahydrogelLinear色谱柱（300 mm×7.8 mm，10 μm）；流速0.6 mL/min；柱温40 ℃；样品溶液质量浓度1 mg/mL；进样20 μL；流动相为0.1 mol/L氯化钠；数据采集时间30 min。通过测定Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500、Dextran T-2000及Glc保留时间绘制标准曲线，从而计算样品的相对分子质量。
1.3.2.3 单糖组成分析
参考Rombouts的方法测定多糖的单糖组成。称取2 mg样品置于安培耐压管中，在加入1 mL 2 mol/L的三氟乙酸后再进行氮吹20 s，继续在120 ℃反应1 h，再加入0.5 mL甲醇，氮气吹干，重复操作2 次，100 mL容量瓶中定容，稀释液经0.22 μm水系滤膜过滤，用Dionex ICS 5000型离子色谱仪进行分析。
色谱条件：流动相A、B、C分别为250 mmol/L NaOH溶液、超纯水和1 mol/L NaOAc溶液；流速0.5 mL/min；柱温30 ℃；检测方式为脉冲安培检测，工作电极Au电极，进样量10 μL；色谱柱为CarboPacTM PA20保护柱（3 mm×30 mm，Dionex，CA）与CarboPacTM PA20分析柱（3 mm×150 mm，Dionex，CA）；洗脱程序见表1。
表1 高效阴离子色谱梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure for high performance anion exchange chromatography
1.3.2.4 红外光谱分析
参考张曼等方法测定多糖的红外光谱。取一定量已干燥好的多糖样品用KBr进行压片，利用傅里叶变换红外光谱仪在500～4 000 cm进行扫描。
1.3.2.5 扫描电镜分析
将样品配制为1.0 mg/mL，冷冻干燥后进行喷金处理，用场发射扫描电镜观察。
1.3.3 体外抗氧化活性测定
1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的测定
参考常相娜等报道方法并稍作修改，测定多糖对DPPH自由基的清除能力。将200 μL各浓度梯度的多糖样品与400 μL 0.4 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合后反应30 min，用酶标仪在波长517 nm处测定吸光度，每个样品做3 个平行。以抗坏血酸（VC）为阳性对照组。对照组用400 μL无水乙醇替代DPPH溶液；空白组用200 μL去离子水替代样品溶液；按式（1）计算清除率：
式中：为对照组吸光度；为样品组吸光度；为空白组吸光度。
1.3.3.2 ABTS阳离子自由基清除能力的测定
参照Ye Zipeng等的方法。25 ℃避光条件下将浓度7.4 mmol/L的ABTS溶液与3.8 mmol/L的过硫酸钾溶液混匀过夜。取适量过夜后的混合液，采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）稀释，至其在波长734 nm处的吸光度为0.70±0.02。
将25 μL样品溶液和250 μL的反应溶液混匀，静置15 min，用酶标仪在波长734 nm处测定吸光度，每个样品做3 个平行。以VC为阳性对照组，对照组用250 μL PBS代替反应溶液；空白组用25 μL去离子水代替样品溶液；按式（1）计算清除率。
1.3.3.3 超氧阴离子自由基清除率的测定
根据检测试剂盒说明书制备工作液。
在避光条件下将25 μL样品与200 μL工作液混匀后加入96 孔板中，37 ℃反应20 min，在波长530 nm处测定吸光度，每个样品做3 个平行。以VC为阳性对照组，对照组用200 μL PBS代替反应溶液；空白组用25 μL去离子水代替样品溶液；按式（1）计算清除率。
1.3.3.4 FRAP测定
依据FRAP试剂盒说明书配制FRAP工作液并预热至37 ℃，将180 μL FRAP工作液与5 μL多糖样品混合，于37 ℃下反应5 min，用酶标仪在波长595 nm处测定吸光度，每个样品做3 个平行，以VC为阳性对照组。以FeSO为参照标准，作浓度变化曲线，在相同条件下测定一定浓度多糖样品的FRAP。
1.4 数据统计分析
运用SPSS统计软件进行分析，采用单因素方差分析进行统计比较。
2 结果与分析
2.1 多糖得率、化学组成及表观形貌
图2 VUP（A）、VUCP（B）和VUHP（C）的扫描电镜图Fig. 2 Scanning electron microscopic images of VUP (A),VUCP (B) and VUHP (C)
经实验研究发现，种皮粗多糖较子叶拥有更高的得率和总糖含量（中性糖与酸性糖之和），得率和总糖质量分数分别为3.8%、88.2%，而子叶粗多糖得率和总糖质量分数分别为2.7%和21.2%，子叶较低的总糖含量可能与其含量较多的蛋白质、淀粉、木质素等杂质有关。鉴于子叶粗多糖中的杂质较多且去除难度大，所以对豇豆多糖的研究可选择得率和总糖含量更高的种皮粗多糖。
由表2可知，经JK008树脂纯化后的3 种多糖总糖质量分数均高于80%，其中VUP、VUCP的总糖质量分数分别提高至87.8%、84.8%，VUHP中总糖含量达到了97.1%，其酸性糖含量明显高于其余2 种纯化多糖，达到41.7%。此前Liu Dan等研究发现，白扁豆皮多糖经DEAESepharose Fast Flow凝胶柱纯化后的主要组分酸性糖含量同样较高，可达43.5%。此外，纯化后的3 种多糖中蛋白质、淀粉及总酚含量均明显低于粗多糖，说明JK008阳离子树脂可以有效的吸附多糖中蛋白质、淀粉及酚类物质。
单糖组成结果显示，VUCP以Ara、Gal、GalA、Glc为主，与VUP单糖组成相类似，VUHP的单糖种类则与VUP、VUCP有一定差异性，即拥有更高含量的Ara、Gala和GalA，同时未检出Glc、Rha、GlcA等单糖，结构相对更简单。Wu Guangjie等研究发现豇豆的单糖组成主要为Gal、Glc和GalA，分别占42.85%、48.97%和5.95%，同时还含有少量Ara，与本研究一致，但在组成比例上存在差异，这种差异可能是由品种不同及是否纯化导致。三者的固体表观形态相似（图2），呈丝状和片状相缠绕的状态，以片状为主。
2.2 分子质量及分布分析
图3 VUP、VUCP、VUHP的分子质量分布曲线Fig. 3 Molecular mass distribution curves of VUP, VUCP and VUHP
如图3所示，VUP及VUCP具有较宽范围的分子质量，在12～18 min内均出现多个峰，表明其分子质量分布不均一，其中VUP以相对平均分子质量为78.4 kDa与1 336.1 kDa的组分为主，分别占比55.6%和23.4%。此结果与Wu Guangjie等报道的100 kDa和24 kDa有较大差异，这种差异可能是豇豆品种及纯化方法不同导致。VUCP以分子质量为103.2 kDa与490.6 kDa的组分为主，分别占比32.7%和25.8%，而VUHP以59.8 kDa（88.1%）为主，且分子质量分布相较其余2 种多糖更加均一。
表2 VUP、VUCP、VUHP的得率及化学组成Table 2 Yields and chemical composition of VUP, VUCP and VUHP %
2.3 红外光谱分析
图4 VUP、VUCP和VUHP红外光谱图Fig. 4 FT-IR spectra of VUP, VUCP and VUHP
如图4所示，3 种多糖红外谱图具有一定的相似性。3 426 cm的吸收峰为糖类O—H的伸缩振动，在2 928 cm处的吸收峰为甲基或亚甲基C—H的伸缩振动，这两个峰是糖类的特征吸收峰。1 626 cm附近的吸收峰可能是羰基C＝O键的伸缩振动峰，证明VUHP、VUCP、VUP中含有糖醛酸，1 436 cm的吸收峰是由C—H变角振动引起，1 084 cm处的吸收峰为吡喃型糖苷的特征吸收峰，由此推测这3 种多糖均含有-吡喃糖环。
2.4 抗氧化分析
图5 VUP、VUCP和VUHP的自由基清除能力测定Fig. 5 Free radical scavenging capacity of VUP, VUCP and VUHP
如图5A所示，VUP、VUCP、VUHP均具有清除DPPH自由基能力，VUP对DPPH自由基清除能力具有显着的剂量效应（＜0.05），当质量浓度为4 mg/mL时，清除率达68.4%。杨强等研究了豇豆全豆多糖清除DPPH自由基的效果，研究表明当多糖质量浓度达到4 mg/mL时，清除率达65%，与本研究结果相一致。在相同质量浓度下，清除能力由强到弱为VUHP＞VUP＞VUCP，当VUHP的质量浓度达到1 mg/mL时，对DPPH自由基的清除能力达到94.8%，接近于同质量浓度VC。
如图5B所示，VUHP、VUP、VUCP均具有良好的清除ABTS阳离子自由基的能力，其中VUHP的清除能力最强（＜0.05），当质量浓度不小于1 mg/mL时其清除能力与同质量浓度的VC接近。此前，Jiang Lian等报道了当绿豆皮多糖MBP-2的质量浓度达到2 mg/mL时，对ABTS阳离子自由基的清除能力也接近于同质量浓度的VC。VUP与VUCP的清除能力与质量浓度呈正相关，在质量浓度为4 mg/mL时清除能力达到最强，分别为83.5%和69.0%，这表明3 种多糖均可以作为有效的ABTS阳离子自由基清除剂。
如图5C所示，3 种多糖对超氧阴离子自由基的清除能力具有显着的剂量效应（＜0.05），清除能力从强到弱为VUHP＞VUP＞VUCP，当质量浓度达到4 mg/mL时，清除率分别达到56.70%、39.87%、19.08%，但都低于同质量浓度阳性对照组的清除率。
如图5D所示，在相同质量浓度下，VUHP的铁离子还原能力显着高于其余2 种多糖（＜0.05），且清除能力具有显着的剂量效应（＜0.05），其FRAP在样品质量浓度为4 mg/mL时达到了3.5 mmol/g，而VUP与VUCP的抗氧化效果并不显着。3 个样品的抗氧化效果均明显低于阳性对照。
3 结论与讨论
对豇豆及其不同部位的多糖分别进行分离纯化，并对结构特征进行比较发现：由单糖组成和分子质量分布可知，VUHP与VUCP均为果胶类酸性多糖。结合粗多糖得率及纯度指标，显示豇豆多糖主要富集于种皮。通过对比3 种多糖纯化前后的化学组成发现，JK008阳离子树脂可以有效吸附多糖中的蛋白质、淀粉和酚类物质，提高总糖含量。
通过对比3 种纯化多糖的抗氧化性发现：VUP、VUCP与VUHP都具有一定的抗氧化活性，其中VUHP的抗氧化活性明显高于其余2 种纯化多糖。VUHP中总酚含量高于VUP与VUCP，这可能是其抗氧化能力强于其他2 种多糖的一个原因。除此之外，结构的差异可能是导致抗氧化能力差异的主要原因。如Shang Hongmei等报道了糖醛酸残基可以改变多糖缀合物的理化性质及溶解度，从而影响多糖的抗氧化活性。Thambiraj等认为半乳糖含量越高，其清除能力可能越强。因此，含有较高的半乳糖和酸性糖可能是VUHP抗氧化活性明显高于VUP、VUCP另外一种因素。此前，Chen Haixia等报道了多糖的抗氧化活性可能与其单糖组成、分子质量等结构特征有关，这与本研究结果相一致，但豇豆多糖抗氧化机制尚需进一步研究。
