硒硫互作对白菜芽苗菜硫代葡萄糖苷含量及抗氧化性的影响

赵 爽，周羽琪，杨旭妍，范震宇，李方全，袁太勇，吴 桐，王玉书

（齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

硫代葡萄糖苷（以下简称硫苷）是十字花科植物中所特有的一类含硫、氮元素的次生代谢产物，其在植物生长发育、风味形成等过程中发挥着至关重要的作用[1]。根据硫苷前体氨基酸侧链基团的不同，硫苷可分为脂肪族（蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）、吲哚族（色氨酸）以及芳香族（苯丙氨酸和酪氨酸）三大类，目前在十字花科植物中已发现近200 种硫苷[2-3]。硫苷在黑芥子酶的作用下水解生成异硫氰酸酯，异硫氰酸酯在抑制I型致癌酶产生的同时，还可激活II型脱毒酶抑制化学致癌基因来发挥其抗癌功效[4]。硫苷及其降解产物除了对多种癌症有一定的预防作用外[5]，还可降低人体心血管疾病的患病风险[6]，并对糖尿病也有一定的预防作用[7]。

硫苷合成过程受温度、光照、营养元素、激素、逆境胁迫等生长环境因素影响，同时硫苷含量也与硫元素密切相关，外源施加硫元素是提高植物中硫苷含量的有效方法。初婷等[8]通过喷施不同浓度的MgSO4显着提高了西蓝花芽苗菜中硫苷含量。Yang Runqiang等[9]研究发现喷施ZnSO4溶液和K2SO4也同样可以显着提高西蓝花芽苗菜的硫苷含量。其原因在于SO42－在被植物吸收后，经过还原同化等反应形成半胱氨酸，为硫苷合成提供原料[10]。而当环境中硫元素不足时，植物通过减少次级代谢产物硫苷的合成和增加硫苷降解来满足初生代谢中对硫元素的需求，从而缓解硫元素缺乏对植物的影响[11]。硒与硫为同主族元素，二者在植物代谢过程中具有协同促进和竞争性抑制关系，然而外源补充硒元素对硫苷的影响尚无一致的结论。有学者证明适当的硒酸盐处理会增加萝卜叶片中硫苷的含量[12]。但Tian Ming等[13]研究表明补充硒元素抑制了硫苷合成基因MYB28和MYB34的表达，从而降低了植株中总硫苷含量及吲哚族、脂肪族硫苷含量。硒是人体必需的微量元素，其形成的硒甲基化合物在抗癌、抗氧化等方面效果显着[14]。

白菜（Brassica rapavar.glabraRegel）口感清甜柔嫩、营养丰富，是世界范围内广泛栽培和食用的叶菜类蔬菜。研究发现十字花科蔬菜芽苗菜硫苷含量及活性成分均显着高于成熟蔬菜[15]。芽苗菜具有种植周期短、种植简单方便、口味独特，绿色安全同时营养价值丰富等优点，但目前在我国，十字花科商品芽苗菜主要以萝卜芽苗菜和西蓝花芽苗菜为主，而对白菜芽苗菜的研究鲜有报道。因此本研究以白菜芽苗菜为试材，研究硒、硫及硒硫联合处理对其硫苷含量和生理生化指标的影响，为开发富硒、高含量硫苷的功能性食品提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘德高536’白菜种子 山东德高种业有限公司。 没食子酸、DEAE-Sephadex A-25 北京索莱宝科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、硫酸酯酶、烯丙基硫苷美国Sigma公司；Folin-酚、甲醇、乙酸钡 国药集团上海化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱静电场轨道阱质谱联用仪 美国赛默飞世尔公司；Optima 7300 DV电感耦合等离子体质谱仪 美国珀金埃尔默公司；WX-8000密闭微波消解系统 上海屹尧仪器科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 种子发芽处理

挑选约1000 粒籽粒饱满的种子于50 mL蒸馏水中浸泡4 h，将其均匀点播在发芽盘（30 cmh 22 cm）中，盘底加400 mL去离子水，每2 d换1 次水，置于25 ℃光照培养箱中，光照16 h/黑暗8 h。第1天各组均喷施20 mL去离子水，此后每24 h各组分别喷施20 mL不同溶液，设置以下不同处理：喷施去离子水为对照，记作CK；喷施4 mmol/L ZnSO4溶液记作S4；喷施50 μmol/L Na2SeO3溶液记作LSe；喷施100 μmol/L Na2SeO3溶液记作HSe；喷施10 mL 4 mmol/L ZnSO4溶液和10 mL 50 μmol/L Na2SeO3溶液记作LSeS；喷施10 mL 4 mmol/L ZnSO4溶液和10 mL 100 μmol/L Na2SeO3溶液记作HSeS。

分别于处理4 d和6 d进行取样，洗净芽苗菜残留溶液，擦干水分，部分鲜样用于测定生理指标，其余样品冷冻干燥后使用高通量研磨仪将叶片粉碎，得到芽苗菜冻干粉末。

1.3.2 形态特征及生长指标测定

从各处理组中随机选取10 株芽苗菜，摆放整齐后，用相机拍摄记录形态特征。随机选取30 株芽苗菜，用游标卡尺测量芽长，并用万分之一天平称质量，计算芽苗菜单株平均质量。

1.3.3 总酚含量和DPPH自由基清除能力测定

上海市家庭医生团队成员对社区药学服务的认知、评价和需求调查 ……………………………………… 沈 美等（13）：1841

取各处理组芽苗菜，参照Wang Mengyu等[16]的方法测定芽苗菜总酚含量；参照龚春燕等[17]的方法测定芽苗菜DPPH自由基清除能力。

1.3.4 硫苷组分及含量测定

硫苷组分及含量测定参考Yin Ling等[18]的方法并稍作修改。称取0.2 g芽苗菜冻干粉末于75 ℃水浴锅中加热1 min，加入4 mL提前预热至75 ℃的70%（体积分数，下同）甲醇溶液和100 μL 5 mmol/L 2-丙烯基硫苷（内标物）溶液，75 ℃水浴10 min，取出冷却后加入1 mL 0.4 mol/L乙酸钡溶液，5000 r/min离心10 min，收集上清液，剩余沉淀再用70%甲醇溶液提取2 次，合并3 次提取的上清液并转移至10 mL容量瓶中定容。取5 mL上述提取液经DEAE-Sephadex A-25阴离子交换柱纯化，提取液排干后向柱中加入250 μL 1.2 mg/mL的硫酸酯酶溶液，于室温下酶解16 h，然后用2 mL去离子水洗脱，所得洗脱液经0.22 μm微孔膜过滤后，采用超高效液相色谱静电场轨道阱质谱联用仪（配备Hypersil GOLD™ C18色谱柱（50 mmh 2.1 mm，1.9 μm））分析硫苷组分及含量。

液相色谱条件：流动相A为0.1%甲酸-水溶液；流动相B为纯甲醇；梯度洗脱程序：0～3 min，2% B；3～20 min，25% B；20～25 min，50% B；25～28 min，2% B；流速0.3 mL/min。

质谱条件：电喷雾正离子源模式；质量范围105～1000m/z；鞘层气体流速35 Arb；辅助气体流速15 Arb；喷雾电压3.50 kV；毛细管温度320 ℃；辅助气体加热器温度300 ℃。

1.3.5 硒、硫元素含量测定

硒、硫元素含量测定参考Tian Ming等[13]的方法并稍作修改。称取0.01 g芽苗菜冻干样品粉末加入微波消解罐中，加入3 mL质量分数36.5%浓盐酸和1 mL质量分数68%浓硝酸，旋紧罐盖，于WX-8000密闭微波消解系统进行消解，消解完成冷却后，用质量分数3%稀硝酸溶液定容至100 mL，利用Optima 7300 DV电感耦合等离子体质谱仪测定硒、硫元素含量。

1.4 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 硒硫互作对白菜芽苗菜生理代谢的影响

2.1.1 白菜芽苗菜形态特征及芽长、单株平均质量

不同处理下芽苗菜生长4 d和6 d的外观形态如图1所示，芽苗菜经4 mmol/L ZnSO4溶液处理后其生长状态相较于对照组受到了明显的抑制，而50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理促进芽苗菜的生长，50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液联合4 mmol/L的ZnSO4溶液处理缓解了4 mmol/L的ZnSO4溶液处理对芽苗菜生长的抑制作用。

图1 不同处理对白菜芽苗菜外观形态的影响Fig.1 Effects of different treatments on morphology of Chinese cabbage sprouts

如图2所示，在白菜发芽期间，芽苗菜的芽长及单株平均质量都随着发芽时间的延长而增加。4 mmol/L的ZnSO4溶液处理后芽苗菜芽长和单株平均质量均显着低于对照组（P＜0.05），50 µmol/L的Na2SeO3溶液处理下芽苗菜的芽长和单株平均质量均最高，且均显着高于相同发芽时间的对照组（P＜0.05）；发芽6 d时，100 µmol/L Na2SeO3溶液处理的芽苗菜芽长及单株平均质量与对照组相比未表现出明显变化。4 mmol/L的ZnSO4溶液分别联合50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理下芽苗菜的芽长和单株平均质量虽然都显着低于相同发芽时间的对照组，但均高于4 mmol/L的ZnSO4溶液处理组，说明Na2SeO3溶液处理会缓解4 mmol/L的ZnSO4溶液处理对芽苗菜生长的抑制作用。

图2 不同处理对白菜芽苗菜芽长（A）和单株平均质量（B）的影响Fig.2 Effects of different treatments on sprout length (A) and average mass (B) of Chinese cabbage sprouts

2.1.2 白菜芽苗菜总酚含量

如图3所示，在芽苗菜发芽期间，总酚含量随着发芽时间的延长而降低，发芽6 d时的总酚含量显着低于发芽4 d时的总酚含量（P＜0.05）。在发芽4 d时，4 mmol/L的ZnSO4溶液处理组总酚含量显着高于对照组，说明4 mmol/L的ZnSO4溶液处理对芽苗菜总酚合成具有一定促进作用；而50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理下芽苗菜总酚含量均低于对照组，分别降低了5.33%和7.13%，其中100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理组总酚含量显着低于对照组（P＜0.05）；4 mmol/L的ZnSO4溶液联合50 µmol/L和100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理组总酚含量分别高于对照组12.87%和6.28%。在发芽6 d时，4 mmol/L的ZnSO4溶液联合50 µmol/L的Na2SeO3溶液处理组总酚含量显着高于其他处理组（P＜0.05），其他处理组之间总体无显着性差异。

图3 不同处理对白菜芽苗菜总酚含量的影响Fig.3 Effects of different treatments on the content of total phenolics in Chinese cabbage sprouts

2.1.3 白菜芽苗菜DPPH自由基清除能力

如图4所示，在芽苗菜发芽期间DPPH自由基清除能力随着发芽时间的延长而降低，各组发芽6 d时的DPPH自由基清除能力显着低于发芽4 d（P＜0.05），同时与对照组相比，在发芽6 d时50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理组DPPH自由基清除能力显着降低（P＜0.05），其他处理组之间总体无显着性差异（P＞0.05）。4 mmol/L的ZnSO4溶液处理组发芽4 d时芽苗菜的DPPH自由基清除能力显着高于对照组（P＜0.05）；4 mmol/L的ZnSO4溶液联合50 µmol/L的Na2SeO3溶液处理组芽苗菜DPPH自由基清除能力均显着高于对照（P＜0.05），而4 mmol/L的ZnSO4溶液联合100 µmol/L Na2SeO3溶液处理组芽苗菜DPPH自由基清除能力略高于相同发芽时间的对照组，但并未达到显着水平（P＞0.05）。

图4 不同处理对白菜芽苗菜DPPH自由基清除能力的影响Fig.4 Effects of different treatments on DPPH radical scavenging capacity of Chinese cabbage sprouts

2.1.4 白菜芽苗菜硒元素和硫元素含量

由图5A可知，在芽苗菜发芽期间，除对照组和4 mmol/L的ZnSO4溶液处理组外，各处理组硒元素含量均随着发芽时间的延长显着升高（P＜0.05）。在发芽4 d或6 d时，无论是50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理组还是4 mmol/L的ZnSO4溶液联合50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理组，芽苗菜硒元素含量均显着高于对照组及4 mmol/L的ZnSO4溶液处理组（P＜0.05），且硒元素含量依次为100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理组＞4 mmol/L的ZnSO4溶液联合100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理组＞50 µmol/L的Na2SeO3溶液处理组＞4 mmol/L的ZnSO4溶液联合50 µmol/L的Na2SeO3溶液处理组＞对照组或4 mmol/L的ZnSO4溶液处理组，随着施用Na2SeO3溶液浓度的升高，芽苗菜中硒元素含量也明显升高，说明Na2SeO3溶液作为富硒食品营养强化剂，其施用浓度与芽苗菜中硒元素含量成正比。如图5B所示，芽苗菜中硫元素含量除4 mmol/L ZnSO4溶液联合100 µmol/L Na2SeO3溶液处理组在发芽6 d时显着升高外，其余各处理组间硫元素含量没有明显的变化，说明硒与硫的施用并不会引起芽苗菜中硫元素含量的变化。

图5 不同处理对白菜芽苗菜硒元素（A）和硫元素（B）含量的影响Fig.5 Effects of different treatments on the contents of total Se (A)and S (B) in Chinese cabbage sprouts

2.2 硒硫互作对白菜芽苗菜硫苷组成的影响

2.2.1 白菜芽苗菜硫苷组分鉴定结果

硫苷极性较强，且不同硫苷单体在结构上只有侧链R基团的微小区别。在正电离子喷雾的碰撞下，已经过硫酸酯酶作用形成的脱硫硫苷失去1分子葡萄糖（m/z162.1），形成特征碎片离子[M-G＋H]＋，同时还易与H＋、Na＋、K＋结合形成[M＋H]＋、[M＋Na]＋及[M＋K]＋离子，因此可通过特征离子计算脱硫硫苷的相对分子质量，进而对硫苷分子进行定性。如表1所示，在白菜芽苗菜中共检测出11 种硫苷成分，分别为脂肪族（6 种）、吲哚族（4 种）、芳香族（1 种）硫苷，并且不同处理组中的硫苷组分相同。

表1 白菜芽苗菜硫苷组分鉴定结果Table 1 Glucosinolates identified in Chinese cabbage sprouts

2.2.2 白菜芽苗菜的硫苷含量

由图6可知，随发芽时间的延长，各组的硫苷含量大体呈增加趋势。发芽4 d时，与对照组相比，不同溶液处理显着提高了芽苗菜5MOSP和4OH的含量（P＜0.05）。与对照组相比，在芽苗菜发芽4 d和6 d时，4 mmol/L的ZnSO4溶液处理总体上提高了各组分硫苷含量；与对照组相比，50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理显着提高了发芽期间（4 d和6 d时）GER含量和发芽4 d时NAS含量（P＜0.05），而发芽4 d时GBC含量无显着变化（P＞0.05）；与对照组相比，相同发芽时间50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理组PRO、GAP、GRA、GBN、NEO含量均显着降低（P＜0.05），而4 mmol/L的ZnSO4溶液联合50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理缓解了单独喷施50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液对硫苷合成的抑制作用。

图6 不同处理对白菜芽苗菜各组分硫苷含量的影响Fig.6 Effects of different treatments on the contents of individual glucosinolates in Chinese cabbage sprouts

2.2.3 不同处理白菜芽苗菜芳香族、脂肪族、吲哚族硫苷及总硫苷含量

发芽6 d时白菜芽苗菜不同类型硫苷含量如表2所示。与对照组相比，4 mmol/L的ZnSO4溶液处理可以显着提高脂肪族、吲哚族、芳香族硫苷及总硫苷含量（P＜0.05）；100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理对芳香族硫苷含量无显着影响（P＞0.05）；50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理均显着降低了脂肪族、吲哚族硫苷及总硫苷含量（P＜0.05）；相对而言，4 mmol/L的ZnSO4溶液联合50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理会缓解50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液对硫苷合成的抑制作用，其总硫苷含量甚至高于4 mmol/L的ZnSO4溶液处理组，其中4 mmol/L的ZnSO4溶液联合50 µmol/L Na2SeO3溶液处理组发芽6 d时总硫苷含量最高，比对照增加约50%，为50 µmol/L Na2SeO3溶液处理组芽苗菜发芽6 d时的2.75 倍。此外，由表2可知，芽苗菜中硫苷主要以脂肪族硫苷为主，约占总硫苷含量的95%。

表2 不同处理对发芽6 d时白菜芽苗菜硫苷含量的影响Table 2 Effects of different treatments on the contents of glucosinolates in Chinese cabbage sprouts on the sixth day of sprouting

3 讨论

硫苷是十字花科植物中特有的一类重要的含氮、硫元素的次生代谢产物及抗氧化物[19]。硫元素作为植物生长过程中所必需的营养元素，是合成蛋氨酸的主要原料，同时蛋氨酸又是硫苷合成的前体氨基酸之一，所以十字花科作物对于硫的需求尤其敏感[20]。因此，许多学者试图通过外源施加硫肥来提高十字花科植物中硫苷含量。在本研究中发现发芽6 d后，与对照组相比，4 mmol/L的ZnSO4溶液处理也可以显着提高脂肪族、吲哚族、芳香族硫苷及总硫苷含量。硫元素和硒元素是同主族元素，二者代谢途径相似，外源硒强化可能会影响含硫代谢产物的形成和降解。Tian Ming[13]和Avila[21]等研究证明外源硒强化会显着降低成熟西兰花中硫苷含量，而对西兰花芽苗菜中的硫苷含量没有影响。但在本研究中发现50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理会显着降低白菜芽苗菜中脂肪族、吲哚族硫苷及总硫苷含量。硒处理虽然能够抑制硫苷的合成，但对硫元素含量无明显影响，推测硒并不是通过抑制硫的吸收而阻碍硫苷的合成。本研究在白菜中检测到11 种硫苷组分，硒、硫和硒硫联合处理对硫苷物质种类没有影响，其中检测出的GRA在白菜类蔬菜中鲜有发现。另外本研究发现白菜中硫苷主要以GAP和GBN为主，约占总硫苷含量的44%和48%，这与Lee[22]、Wei Jia[23]等研究大白菜和小白菜硫苷组成的结果相似，而且这些物质对白菜类蔬菜风味形成具有重要影响[24]。

硫苷能够起到抗癌作用的主要原因是其降解产物异硫氰酸酯具有一定的抗肿瘤活性[25]。GBC、NAS以及GRA产生的异硫氰酸酯为吲哚-3-甲醇、苯乙基异硫氰酸酯以及萝卜硫素，它们对乳腺癌及宫颈癌有一定的抑制作用[26-28]。因此，开发高GBC、NAS、GRA含量的蔬菜具有一定意义。本研究中4 mmol/L的ZnSO4溶液处理可以显着提高GBC和NAS含量，而GRA含量提高尚未达到显着水平。硒处理显着降低GRA和GBC含量，而4 mmol/L的ZnSO4溶液联合50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理可以缓解50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理的抑制作用，因此硒硫互作处理可以获得高硫苷富硒芽苗菜产品。同时本研究结果表明发芽6 d时大部分处理组硫苷含量明显高于4 d时硫苷含量，这和Bellostas等[29]在研究卷心菜和花椰菜时得出发芽7 d时总硫苷含量较4 d显着增加的结果相一致，但却与韩宇等[30]的研究结果相反，推测可能与研究对象物种和品种不同有关。但考虑到并不是所有的硫苷都对人体有积极作用，例如PRO降解产物噁唑烷硫酮就会对人体产生一定的毒害作用[31]，基于本研究结果选择发芽6 d时的白菜芽苗菜更具有营养价值。总酚是植物中重要的抗氧化物质，对自由基具有一定的清除能力。本研究中4 mmol/L的ZnSO4溶液处理显着提高了芽苗菜的总酚含量，这是由于4 mmol/L的ZnSO4溶液抑制芽苗菜生长从而促使总酚累积，相应地DPPH自由基清除能力也显着提高。相反，50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理会降低芽苗菜中总酚含量，导致DPPH自由基清除能力下降，此结果与田明[32]的研究结果相似。本研究可为培育富硒又具有较高含量活性物质的十字花科蔬菜芽苗菜提供一定的参考。

4 结论

本研究结果表明，4 mmol/L的ZnSO4溶液处理对白菜芽苗菜造成生长胁迫，单独施用Na2SeO3溶液可增加芽长和芽苗菜单株平均质量，而50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液联合4 mmol/L的ZnSO4溶液处理可以有效缓解4 mmol/L的ZnSO4溶液对白菜芽苗菜生长发育的抑制作用。4 mmol/L的ZnSO4溶液联合50、100 µmol/L的Na2SeO3溶液处理后，白菜芽苗菜硒元素含量、总抗氧化能力及硫苷含量均有所提高，其中以4 mmol/L的ZnSO4溶液联合50 µmol/L Na2SeO3溶液处理效果最好。大体上各组发芽6 d时的芽苗菜硒元素含量和总硫苷含量明显高于发芽4 d时的芽苗菜。本研究结果可为具有高营养价值和保健功能芽苗菜的开发利用提供参考。