灌胃纳米超氧化物歧化酶脂质体对小鼠溃疡性结肠炎的改善作用

黎俏灵，李鹤年，郭静科，朱则亮，滕 薇，胡雨嘉，罗圆圆，王梦田，刘树滔,*

（1.福州大学生物工程研究所，福建 福州 350002；2.福州大学至诚学院，福建 福州 350002）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种特发性肠道炎症，可导致便血便稀、腹痛、体质量下降，甚至胃肠道穿孔、排泄失禁等症状[1]，极大地危害了人们的身心健康；且UC近年来发病率持续上升，已成为全球性备受关注的问题[2]。目前UC病因的潜在机制尚未完全阐明，但有研究表明氧化应激是导致UC的一个重要的因素。活性氧（reactive oxygen species，ROS）指通过氧分子还原产生的初始物质及其次级反应产物，具有高度反应活性。当机体内ROS过量生成且无法被及时清除时便会破坏原有的氧化还原稳态，从而导致氧化应激，进而引起细胞膜脂质过氧化作用并造成机体的损伤，包括肠道通透性增加甚至肠道细胞溶解，导致UC发生[3-4]。过量的ROS会破坏肠上皮细胞蛋白，进而破坏胃肠道屏障，增加肠道通透性，导致炎症的发生[5]。很多研究表明肠黏膜中ROS的过量产生可增强炎症反应，导致黏膜损伤，加速炎症反应，发生肠溃疡[6]。因此，清除ROS已被用作缓解UC的有效策略[7-9]，如周晓玲等[9]的研究中发现南极磷虾油可以通过提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶的表达以及调节核因子红细胞2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白（Kelchlike ECH-associated protein，Keap）1信号通路减少ROS含量，从而改善UC小鼠的氧化损伤。

SOD是一种内源性抗氧化物酶，能催化超阳阴离子自由基生成O2和H2O2。SOD具有抑制ROS作用，并由于其良好的抗炎、抗氧化等活性，在保健食品或者食品营养强化剂中具有广泛的应用，因此SOD可作为食品功能因子预防或者缓解UC症状[10-12]。但SOD在胃肠道中的性质不稳定，口服后易因胃液极低的pH值和胃蛋白酶破坏损失酶活性[13-14]，因此，SOD在实际应用中常需要通过变性、重组、修饰和包埋等手段提高其生物利用度[15-16]。

纳米递送具有低毒副作用、高稳定性、缓释和控释活性物质及蛋白靶向释放等优点，因此纳米递送系统在活性物质递送和营养素递送领域中受到广泛关注和研究[17]。目前递送系统主要包括纳米乳、纳米囊、脂质体纳米颗粒和聚合物胶束等[18]，已被运用于各种天然活性成分、营养素以及微量元素的递送。其中脂质体由可食用的生物材料组成，具有无毒、可缓释活性物质和生物相容性高等优点[19]，因此被广泛用于天然活性成分递送系统，如Jubeh等[20]发现经脂质体包埋后的SOD能更好地降低UC大鼠结肠组织中乳酸脱氢酶含量进而预防肠道氧化应激损伤；周建森等[21]评估发现反式激活蛋白-SOD经过脂质体包埋后对于UC大鼠具有更好的改善作用，且脂质体包埋可以提高反式激活蛋白-SOD对胃酸及胃蛋白酶的耐受性，降低机体内氧化应激水平，进而修复结肠组织损伤并发挥其改善UC的作用。

基于口服给药方便且使用依从性高，蔡丽萍等[22]通过加热制备自组装SOD纳米颗粒物以提高SOD的活力、稳定性以及其生物利用度。本实验将纳米-SOD（nano-SOD，以下简称ΔSOD）包埋于脂质体中得到L-ΔSOD，探讨L-ΔSOD改善UC模型小鼠的作用。SOD在水溶液中加热易于自组装成纳米颗粒，而脂质体包封过程简单且可重复，有利于维持蛋白质的生物活性并提高SOD在胃肠道中的稳定性，并有利于SOD靶向至炎症部位[23-24]。所以本实验分析脂质体包埋ΔSOD对UC模型小鼠的改善作用，以期为UC的辅助治疗食品研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

ICR清洁型小鼠购于浙江省实验动物中心，生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002。

SOD冻干粉 天津生命科学研究所；胆固醇、胃蛋白酶（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）Annexin V细胞凋亡检查试剂盒I 生工生物（上海）股份有限公司；胰酶（分析纯） 美国Amersco公司；大豆卵磷脂（分析纯） 萨恩化学技术（上海）有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、细胞增殖试剂盒（cell-counting kit，CCK）-8、Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）培养基、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 大连美仑生物技术有限公司；葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）（纯度≥98%） 美国MP Biomedicals公司；HiScript®II Q RT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper）、ChamQ Universal SYBR®qPCR Master Mix试剂盒 南京诺唯赞生物科技股份有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、TritonX-114（纯度≥99%） 美国Sigma公司；髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、GSH-Px试剂盒 南京建成生物研究所。

1.2 仪器与设备

1384型生物安全柜、3111型CO2培养箱、石蜡切片机美国Thermo Forma公司；CFX96实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）仪 美国Bio-Rad公司；AE-6450蛋白电泳仪美国ATTO公司；JS-680D全自动凝胶成像仪 上海培清科技公司；KZ-III匀浆仪 美国Servicebio公司；Cp70ne超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器公司；Nano ZS90激光粒度仪 美国Malvern Panalytica公司；SpectraMax ID3多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司；CARY50紫外-可见分光光度计 美国VAP公司；A1激光共聚焦显微镜 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 ΔSOD的制备与活力的测定

配制1.00 mg/mL的SOD溶液，于60 ℃水浴锅中预热1 h后，再75 ℃加热1 h，得到粗纳米SOD颗粒；经超滤和0.45 μm滤膜过滤后，得到ΔSOD，然后利用盐酸羟胺法[22]测定SOD活力，并用于后续实验研究。

1.3.2 ΔSOD在Caco-2细胞中的跨膜能力分析

将需要偶联的SOD和ΔSOD蛋白用碱性碳酸反应液（17 g NaCO3和28 g NaHCO3溶解于1 L去离子水）透析1 h，然后分别取300 μL于盛有20 μL FITC 1.5 mL棕色EP管中，避光振荡反应1 h；把标记好的蛋白样品装于1 mL的Sephadex G-25 Superfine凝胶柱中，洗脱后得到SOD-FITC和ΔSOD-FITC溶液[23,25]。将对数生长期的Caco-2细胞以4h 104个/孔接种于24 孔板中，在培养箱（37 ℃、5% CO2，下同）中孵育24 h，待细胞完全贴壁后吸弃培养液，然后每孔加入400 μL含0.50 mg/mL SOD-FITC或ΔSOD-FITC溶液的完全培养基，在培养箱中孵育3 h；取200 μL培养液于不透光的96 孔板中，用多功能酶标仪检测细胞荧光强度，激发波长485 nm，发射波长535 nm。按照BCA试剂盒说明书测定细胞蛋白含量。以1 mg蛋白对应的荧光强度表征跨膜能力。

1.3.3 ROS水平的测定

取生长良好的Caco-2细胞接种于24 孔板和激光共聚焦培养皿中，在培养箱中孵育24 h，待细胞贴壁后，弃去培养液，加入400 μL含有500 U/mL SOD及ΔSOD的DMEM孵育3 h后，在避光条件下用培养基稀释DCFH-DA探针至5 µmol/L，按照500 µL/孔加入含DCFH-DA的培养基，培养箱中继续培养30 min后，每孔加入100 μL H2O2溶液（终浓度200 μmol/L）氧化刺激3 h后吸弃培养液，PBS清洗3 次，每孔加入250 μL细胞裂解液，振荡2 min，4 ℃静置15 min，常温下1200 r/min离心5 min，取200 μL于不透光的96 孔板中，用多功能酶标仪检测细胞荧光强度，激发波长485 nm，发射波长535 nm。按照BCA试剂盒说明书测定细胞蛋白含量，以1 mg蛋白对应的荧光强度表征ROS水平。参照上述方法处理激光共聚焦培养皿中的Caco-2细胞，并采用激光共聚焦显微镜观察。

1.3.4 ΔSOD脂质体的制备与包埋率的测定

采用逆向蒸发法制备L-ΔSOD。称取一定量的ΔSOD冻干粉溶于0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，使其终质量浓度为1 mg/mL；将质量比为4∶1的卵磷脂和胆固醇混合物按照质量比1∶3溶解于乙醚中，将上述有机相与ΔSOD溶液按照体积比3∶1混合，超声处理6 min，形成稳定的油包水型乳液。将所得乳液于40 ℃下减压旋转蒸发以除去有机溶剂，形成乳浊液。获得的乳浊液经过8000hg离心5 min，收集的上清液即为粒径均匀的L-ΔSOD悬液，于4 ℃冰箱避光保存中备用[26]。将5 mL L-ΔSOD稀释7 倍，4 ℃、100000hg离心10 min，收集上清液为游离的ΔSOD，利用BCA试剂盒测定其蛋白质量浓度，按照式（1）计算包埋率。

1.3.5 ΔSOD以及L-ΔSOD性质表征

采用激光粒度仪测定ΔSOD和L-ΔSOD的粒径、ζ电位、多分散指数（polydispersity index，PDI）。

1.3.6 ΔSOD脂质体在模拟消化液中的降解情况

参考Brodkorb等[27]的方法配制含胃蛋白酶（2000 U/mL）、pH 2.0的模拟胃液（simulated gastric fluid，SGF）以及含胰蛋白酶（100 U/mL）、pH 7.0的模拟肠液（simulated intestinal fluid，SIF），将1.00 mg/mL ΔSOD与L-ΔSOD分别与SGF以体积比1∶3混合，于37 ℃振荡水浴，并分别测定0、0.5、1.0、2.0 h时SOD活力/（U/mL），然后将模拟胃液消化2.0 h后的混合液与SIF以体积比1∶2混合后于37 ℃振荡水浴120 min测定SOD活力/（U/mL）。SOD活力回收率按式（2）计算。

1.3.7 动物实验

1.3.7.1 动物分组

将36 只ICR雄性小鼠适应性喂养7 d后开始动物实验。将小鼠随机分成2 组：正常组小鼠（6 只）饮用无菌水，模型组小鼠（30 只）自由饮用3.0 g/100 mL DSS溶液，连续饮用7 d，期间环境及饲养条件保持不变，在造模期间每天固定时间测定小鼠体质量、粪便形态及血便程度指标。造模结束后，进行疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分，并将模型组小鼠随机分为5 组：模型组、SOD组、ΔSOD组、空白脂质体（L）组和L-ΔSOD组，每组6 只。各组分别灌胃0.02 mL/（gmbg d）灭菌水、SOD溶液、ΔSOD乳液、空白脂质体（不添加SOD）、L-ΔSOD乳液，SOD干预剂量50 U/（gmbg d），连续灌胃7 d，每天进行DAI评分。干预结束后，小鼠禁食禁水12 h，采用颈椎脱臼处死小鼠，解剖后收集直肠观察并拍照，测定直肠长度同时收集小鼠脾脏和结肠。

1.3.7.2 疾病活动指数及结肠黏膜损伤指数测定

DAI可用于评估UC的严重程度，评分具体细则如表1[28-29]所示，每天固定时间称量小鼠体质量、观察粪便形态和血便情况，以3 项指标评分的平均值作为DAI评分。参考Wallace等[30]的结肠黏膜损伤指数（colonic mucosal damage index，CMDI）评分标准（表2）进行评价，并按照式（3）计算结肠密度。

表1 DAI评分标准[28-29]Table 1 Criteria for DAI scores[28-29]

表2 CMDI评分标准[30]Table 2 Criteria for colonic mucosal damage index (CDMI) scores[30]

1.3.7.3 小鼠脾脏系数测定

参照文献[31]的方法，解剖小鼠取脾脏并称质量，按式（4）计算脾脏系数。

1.3.7.4 结肠组织的苏木精-伊红染色

采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）试剂对质量分数4%多聚甲醛溶液固定的小鼠结肠组织进行染色处理。

1.3.7.5 结肠组织氧化指标的测定

取结肠组织按照1∶9（m/V）添加质量分数0.9%生理盐水制备结肠组织匀浆，4 ℃、3000 r/min离心10 min，收集上清液备用。采用BCA试剂盒测定蛋白质含量。参考对应试剂盒说明书测定结肠组织中氧化应激相关指标MDA含量和GSH-Px活力。

1.3.7.6 促炎因子质量浓度的测定

参考对应酶联免疫吸附试验试剂盒说明书测定结肠组织中促炎细胞因子（肿瘤坏死因子（tumor necrosisi factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-6与IL-1β）的质量浓度。

1.3.7.7 结肠组织紧密连接蛋白mRNA相对表达水平测定

使用TRIzol试剂提取小鼠结肠组织总RNA，使用HiScript®II Q RT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper）试剂盒逆转录合成cDNA，再用ChamQ Universal SYBR®qPCR Master Mix试剂盒测定紧密连接蛋白基因（ZO-1和Occludin）mRNA相对表达水平，以正常组为对照，引物序列如表3所示。

表3 qPCR引物序列Table 3 Sequences of the primers used for real-time polymerase chain reaction

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2010软件对数据进行处理分析，结果以平均值±标准差表示，采用SPSS Statistics 24软件进行Duncan多重比较检验，P＜0.05表示差异显着。采用GraphPad Prism 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 ΔSOD活力

SOD经过一定条件的加热导致α-螺旋含量显着减少、β-折叠和无序结构含量显着增加而发生变性，从而使SOD聚集体絮凝成纳米颗粒；天然的SOD活力为（26512.41±2732.09）U/mL，经2 h的加热后得到ΔSOD活力比天然SOD提高了26.81%，可能具有更高的生物活性，SOD的每个亚基的活性中心是由β-折叠互相环绕而形成的活性通道[32]，ΔSOD活力更高可能是由于其中的β-折叠含量上升。

2.2 ΔSOD在Caco-2细胞中的跨膜能力

细胞受损后，胞内会产生大量的自由基，而细胞内有限的SOD无法达到清除效果，细胞需借助外源抗氧化物酶，使SOD与ROS维持平衡，才可以有效地清除细胞内的自由基。本实验利用荧光标记的方法来评估ΔSOD的跨膜能力，由图1可知，FITC标记的蛋白孵育Caco-2细胞3 h后，ΔSOD组跨膜能力显着提高至SOD组的（2.89±0.20）倍（P＜0.05），表明ΔSOD比SOD具有更显着的跨膜效果。有研究表明纳米颗粒能附着在细胞膜上，细胞膜内陷形成小囊，颗粒会被包围在小囊内，然后小囊从细胞膜上分离而形成小泡，通过内吞作用进入细胞内部；内吞作用包括吞噬和胞饮作用，当纳米颗粒的直径小于500 nm时，其通过胞饮作用进入细胞[33]。相比于SOD，ΔSOD因其纳米性质具有的黏附细胞膜的能力，并由于其是纳米级颗粒，能通过胞饮作用方式更多地跨膜进入细胞。

图1 SOD和ΔSOD对Caco-2细胞跨膜能力的比较Fig.1 Comparison of transmembrane capacity SOD and ΔSOD for Caco-2 cells

2.3 ΔSOD的ROS清除能力

H2O2进入细胞发生Fenton反应产生大量的羟自由基，导致机体产生严重的氧化应激[34-35]。将Caco-2细胞分别与等浓度的天然SOD和ΔSOD混合进行孵育3 h，通过多功能酶标仪和激光共聚焦显微镜探究SOD和ΔSOD清除ROS的能力[22]。定量分析结果如图2A所示，正常组与模型组中ROS水平具有显着差异（P＜0.05），表明H2O2能刺激细胞产生大量的ROS。与模型组相比，SOD与ΔSOD ROS水平显着降低（P＜0.05），且SOD与ΔSOD的ROS清除效果具有显着性差异（P＜0.05）；如图2B所示，模型组和SOD组因细胞产生了大量自由基而导致荧光强度很高。相比模型组，SOD和ΔSOD均可显着降低荧光强度，而ΔSOD组荧光强度相对于SOD组弱，表明ΔSOD的清除效果更强。其原因是在相同蛋白质量浓度下ΔSOD比SOD活力高且具有更好的跨膜效果，因此ΔSOD更易进入细胞内发挥更强的自由基清除能力，进而更好地减弱荧光强度。目前关于SOD缓解UC症状的研究很多，但与已报道的从嗜热菌中分离的超稳定的SOD[36]相比，本实验的SOD纳米颗粒制备简单、酶活力高、细胞跨膜以及ROS清除能力强，具备显着生物活性，因此有利于探究ΔSOD缓解UC症状的效果。

图2 ΔSOD对由H2O2诱导Caco-2细胞产生ROS的清除效果Fig.2 Scavenging effect of ΔSOD on free radical produced by Caco-2 cells induced by H2O2

2.4 L-ΔSOD的性质表征

如表4所示，L-ΔSOD平均粒径为（276.60±1.78）nm，ζ电位为（－31.30±0.14）mV，PDI为0.254±0.014。由于纳米体系中ζ电位的绝对值越大，表明体系越稳定，因此ζ电位可作为考察纳米颗粒稳定性的指标[37]。因此，与ΔSOD（（－11.44±1.17）mV）相比，L-ΔSOD具有较高的稳定性；L-ΔSOD的包埋率为（29.72±0.01）%，能够对ΔSOD起到一定的保护作用。

表4 L-ΔSOD的性质Table 4 Characteristics of L-ΔSOD

2.5 L-ΔSOD体外模拟胃肠道的稳定性

如表5所示，在SGF的作用下，ΔSOD的活力迅速降低，0.5 h后几乎全部失活，这表明ΔSOD易受到胃酸和胃蛋白酶的破坏与降解[13,38]。而ΔSOD经脂质体包埋可以减少酶活力的损失，L-ΔSOD活力为（3157.75±206.12）U/mL，经过体外胃肠液消化后的Δ S O D 活力为（1278.23±15.01）U/mL，酶活力回收率为40.90%，表明脂质体对胃肠液在一定程度上具有耐受性，有利于研究口服ΔSOD脂质体对UC症状的作用效果[39]。

表5 ΔSOD和L-ΔSOD模拟消化后的活力及其活力回收率Table 5 Residual activity and activity recovery rate of ΔSOD and L-ΔSOD after simulated digestion

2.6 L-ΔSOD对UC小鼠DAI评分的影响

DSS破坏结肠黏膜屏障，导致肠道炎症发生、出现体质量减轻、便血便稀等临床症状，DAI评分是评价结肠炎严重程度的一个指标。如图3所示，经7 d造模后，除正常组外，其余各组DAI评分均维持在一定水平，表明造模成功。以不同样品灌胃干预7 d后，各样品均可以不同程度地降低小鼠DAI评分。与模型组相比，样品组以不同程度降低小鼠的DAI改善小鼠UC，缓解小鼠便血便稀等病理学特征。其中样品组缓解UC模型小鼠的病理学特征作用依次为L-ΔSOD＞ΔSOD＞SOD＞空白脂质体。

图3 小鼠灌胃阶段DAI（A）与第14天DAI（B）评分Fig.3 DAI score during intragastric administration (A) and DAI score on the 14th day (B)

2.7 L-ΔSOD对UC小鼠结肠组织形态的影响

当小鼠结肠遭DSS损伤时，结肠容易发生充血肿胀现象，其中CMDI可以反映结肠大体损伤程度，同时从形态学角度分析L-ΔSOD对UC小鼠的改善情况。如图4A所示，正常组结肠组织呈均匀细长状，肠壁细腻光滑有弹性，无充血肿胀现象；模型组的结肠组织呈充血肿胀状态，近盲肠端肿胀尤为明显，肠壁质地脆弱且极易断裂，肉眼可见盲肠与结肠内含血性不成形的粪便内容物[40]；样品组的结肠组织形态相比于模型组均有不同程度的好转，结肠充血现象且肿胀程度大幅减轻，肠壁质地恢复一定的弹性且不易断裂尤其是L-ΔSOD组结肠已接近正常结肠组织形态。如图4B所示，与模型组相比，样品组的CMDI均下降，其中样品组降低小鼠CMDI的能力依次为L-ΔSOD＞ΔSOD＞SOD＞空白脂质体，表明L-ΔSOD恢复结肠组织形态为最佳。

图4 小鼠结肠组织形态（A）和小鼠CMDI评分（B）Fig.4 Morphology (A) and CMDI score (B) of mouse colon tissue

2.8 L-ΔSOD对UC小鼠结肠长度和密度的影响

DSS诱导的UC模型容易发生纤维化导致结肠长度缩短和结肠密度升高，可通过结肠长度和密度评估样品改善UC的效果。由图5可知，与模型组相比，样品组结肠长度增加，结肠密度降低，其中ΔSOD和L-ΔSOD改善效果最显着（P＜0.05），而空白脂质体的干预对其无显着影响（P＞0.05）。

图5 小鼠结肠长度（A）和结肠密度（B）Fig.5 Length (A) and density (B) of mouse colon tissue

2.9 L-ΔSOD对UC小鼠脾脏系数的影响

脾脏作为机体的免疫器官，当机体发生UC炎症时脾脏会肿大，因此脾脏系数能从侧面评估L-ΔSOD改善UC的疗效。如图6所示，与模型组相比，样品组的脾脏系数均显着降低（P＜0.05），其中样品组降低UC模型小鼠脾脏系数的能力依次为L-ΔSOD＞ΔSOD＞SOD＞空白脂质体，且L-ΔSOD组的脾脏系数显着低于SOD组（P＜0.05），表明SOD通过自组装和脂质体包埋后能更有效地改善UC。

图6 小鼠脾脏系数Fig.6 Spleen index of mice

2.10 L-ΔSOD干预后UC小鼠结肠组织切片染色观察结果

如图7所示，正常组小鼠结肠的黏膜上皮细胞结构完整，无肿胀现象，隐窝结构规则，肠绒毛结构完整，杯状细胞含量高。模型组小鼠结肠糜烂，腺体结构破损，隐窝结构呈不规则状态，肠绒毛变形破损，杯状细胞缺失，伴有大量炎症细胞浸润。与模型组相比，SOD、L、ΔSOD组和L-ΔSOD组均有明显修复，其中ΔSOD组与L-ΔSOD组修复效果更加明显，结肠表现和正常组相似。说明各样品组对DSS诱导的UC模型中均有修复作用，各样品修复UC模型小鼠的结肠状态的效果依次为L-ΔSOD＞ΔSOD＞空白脂质体＞SOD。

图7 小鼠结肠组织病理切片HE染色结果（200×）Fig.7 Hematoxylin-eosin staining results of pathological sections of mouse colon tissue (200 ×)

2.11 L-ΔSOD对UC小鼠的结肠抗氧化指标的影响

GSH-Px具有抗氧化作用，在机体中作为质子供体清除H2O2以及脂质氢过氧化物。氧化应激会引起细胞膜的脂质过氧化，而MDA是脂质过氧化的终产物之一[41]。如图8所示，相比模型组，L-ΔSOD中的GSH-Px活力显着增加（P＜0.05），MDA含量明显降低，说明L-ΔSOD在一定程度上能有效改善UC氧化应激。

图8 小鼠结肠内GSH-Px活力（A）和MDA含量（B）Fig.8 GSH-Px activities (A) and MDA contents (B) in mouse colon

2.12 L-ΔSOD对UC小鼠结肠炎症因子质量浓度的影响

DSS诱导的UC模型会有大量炎性细胞浸润至结肠黏膜固有层，炎性介质使巨噬细胞转化为促炎表型从而被激活，产生大量促炎细胞因子如TNF-α、IL-6以及IL-1β[42]。如图9所示，相对于模型组，样品组均可以不同程度地降低促炎性因子释放量，其中以ΔSOD和L-ΔSOD效果最显着（P＜0.05），表明两种样品均可以通过降低促炎性因子释放量、减轻促炎性因子浸润来改善UC。

图9 小鼠结肠内TNF-α（A）、IL-6（B）以及IL-1β（C）质量浓度Fig.9 TNF-α (A),IL-6 (B) and IL-1β (C) contents in mouse colon

2.13 L-ΔSOD对UC小鼠的结肠紧密连接蛋白mRNA相对表达水平的影响

有缺陷的肠上皮紧密连接屏障是导致UC发展的重要因素，紧密连接（tight junction，TJ）中的两种关键蛋白ZO-1和Occludin是肠道屏障的重要组成部分，可通过调节上皮细胞的屏障功能和肠道屏障的选择通透性来预防炎症发生[43-44]。如图10所示，DSS诱导的UC模型小鼠中ZO-1和Occludin表达量显着降低，表明UC模型小鼠肠黏膜屏障受到损伤。L-ΔSOD组可以显着促进ZO-1和Occludin表达（P＜0.05），结合小鼠总体状态，结果表明L-ΔSOD可以通过促进ZO-1和Occludin表达来修复肠黏膜屏障损伤，进而改善UC。

图10 小鼠结肠组织内ZO-1（A）和Occludin（B）mRNA相对表达水平Fig.10 Relative mRNA expression levels of ZO-1 (A) and Occludin-1 (B)in mouse colon tissues

3 结论

本实验利用SOD加热自组装形成ΔSOD纳米颗粒，其活力较天然SOD提高26.81%；FITC荧光标记实验结果表明ΔSOD跨膜能力是天然SOD的（2.89±0.20）倍；通过多功能酶标仪和共聚焦显微镜探究SOD和ΔSOD清除ROS能力，结果表明ΔSOD清除由H2O2诱导Caco-2细胞产生的ROS的能力更强。利用逆向蒸发法制备的ΔSOD脂质体的包埋率为（29.72±0.01）%，模拟胃肠道稳定性实验结果显示包埋于脂质体内的ΔSOD在模拟胃肠道中的保留率达到40%左右，有利于口服L-ΔSOD缓解UC症状。在动物实验中，使用DSS对小鼠造模，造模成功后，利用SOD、ΔSOD、空白脂质体和L-ΔSOD进行灌胃实验。结果显示：样品组均可降低UC模型小鼠的DAI评分，恢复结肠长度、降低结肠密度和CMDI评分，与模型组相比空白脂质体和SOD组均无显着性差异，而ΔSOD和L-ΔSOD均有显着性改善（P＜0.05）；通过结肠组织病理切片分析，样品组可以恢复UC模型小鼠黏膜上皮细胞结构完整性，增加杯状细胞含量以及修复隐窝结构和肠绒毛结构，减轻炎性细胞在黏膜下层的浸润，其中L-ΔSOD修复效果最为显着，基本达到与正常组相似水平；同时L-ΔSOD可以降低结肠组织MDA含量、降低结肠组织中的TNF-α、IL-6与IL-1β等促炎细胞因子质量浓度，减轻结肠组织过氧化损伤；提高结肠组织GSH含量和ZO-1和Occludin相对表达水平，进而提高结肠组织抗氧化以及肠道屏障功能，降低肠道内氧化应激，发挥保护肠道、抑制炎症作用。

综上所述，灌胃L-ΔSOD相比于SOD、ΔSOD对于DSS诱导的UC模型小鼠有着更优异的炎症缓解效果，这可能是因为SOD经过自组装后形成的纳米颗粒具有更高的酶活力和稳定性，赋予其更强的自由基清除能力，并且脂质体对ΔSOD有良好的保护作用，使ΔSOD在胃肠道刺激下能保持良好的酶活力。因此，L-ΔSOD作为食品功能因子通过饮食干预进行预防和缓解UC症状是具有良好的应用前景。此外，目前的研究仅限于DSS诱导的小鼠急性结肠炎，还需要在其他临床UC模型中进行验证。总之，这些结果表明SOD经过自组装形成的纳米颗粒有良好的生物利用度。本研究可促进基于ΔSOD作为食品功能因子在许多其他炎症性疾病中的应用。