周宏 李文平 裴斐 吴刚
头颈部恶性肿瘤主要病理类型为鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC），具有高发病率和死亡率，严重威胁人类健康。从解剖位置上包括鼻咽癌、口咽癌、下咽癌、口腔癌和喉癌[1]。据统计，每年全世界有50万HNSCC新患者被发现[2]。研究证实，HNSCC发生与烟草、酒精及人类乳头状病毒感染密切相关[3]。目前，早期HNSCC治疗主要以手术和放化疗为主，晚期HNSCC以多学科综合治疗为主。尽管治疗手段的多样性，但患者的生存率还是比较低。越来越多的研究表明，分子标志物的检测可以评估头颈部肿瘤的预后。
PPFIA基因家族包括PPFIA1，PPFIA2，PPFIA3，PPFIA4。其基因家族成员在人体内具有不同的生理功能，在各种不同恶性肿瘤中均有不同程度的表达，直接参与恶性肿瘤细胞的迁移与侵袭[4]。PPFIA1在20%的乳腺癌中高表达，影响人乳腺细胞的迁移与侵袭功能[5]。PPFIA2作为一种近视进展的分子机制也得到较大的关注[6]。PPFIA3基因甲基化可作为一种分子标志物来评估胃癌的发生发展[7]。PPFIA4在心脏、脑、骨骼肌肉中均有不同程度的表达[8]。因此，本研究进一步探讨PPFIA基因家族在HNSCC中的表达情况，分析PPFIA1在HNSCC中的表达及预后意义。
1 材料和方法
1.1 从Oncomine数据库提取数据
Oncomine数据库(www.oncomine.org)是一个癌基因芯片数据库，主要提供肿瘤基因的相关信息，可以呈现可视化结果。本研究设定筛选条件，具体如下：（1）Gene：PPFIA1；（2）Cancer Type：Head and Neck Cancer；（3）Data Type：mRNA；（4）Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis。通过选择PPFIA家族成员在癌组织与正常对照组织之间表达的倍数关系、P值来显示结果，分析在mRNA水平上PPFIA家族成员在头颈部鳞癌与正常黏膜组织表达的差异性。
MA 是一类由微生物产生的、分子内含有大环内酯环的生物活性物质，其根据分子中内酯键的数量不同有大环一内酯至大环多内酯多种结构；另按照内酯环的大小又可分为十二元环、十四元环、十五元环等，目前最大可至六十元环。除以上一般分类的 MA 外，还有多烯大环内酯、安莎大环内酯与酯肽等。
1.2 从cBioPortal数据库提取数据
cBioPortal数据库（www.cbioportal.org）整合了癌症基因图谱（TCGA）和国际癌症基因组联盟（ICGC）等多个数据库的数据，主要提供癌症基因组数据、综合分析基因组数据和临床资料等。检索cBioPortal数据库，依次勾选Head and Neck；Head and Neck Squamous cell carcinoma（TCGA, Provisional）；mRNA Expression z-Scores（RNA Seq V2 RSEM）， 输 入 基 因 PPFIA1， 获 得 与PPFIA1基因相关的数据，分析PPFIA1 mRNA在HNSCC中的表达与预后的相关性。
1.3 RT-PCR方法检测PPFIA1 mRNA在喉鳞癌中的表达情况
病例标本来源于2017年1-11月在复旦大学附属浦东医院接受手术的26例喉癌患者，其中男24例，女2例；年龄42～75岁。术前未行放化疗，术后组织病理诊断均为喉鳞状细胞癌，为原发肿瘤。术中快速将配对的癌组织和癌旁新鲜组织标本装在2 ml冻存管中，标记后快速放进液氮罐，在-80℃冰箱保存备用。
采用Trizol法提取喉癌组织及正常对照组织的总RNA。用Qiagen公司反转录试剂盒将mRNA转录为cDNA。以cDNA为模板在ABI ViiA7实时定量PCR仪中进行后续荧光定量PCR反应。引物购置生工生物工程（上海）股份有限公司，PPFIA1基因及内参的引物序列如下：引物：PPFIA1上游5'-ACCAAAGGACATTCGTGGCT-3'，下 游5'-AAAGCTGCTCATGCTCCCA-3'。GAPDH引 物： 上 游5'-TGCCCTCAACGACCACTTT-3'， 下 游 5'–GGTCCAGGGGTCTTAC TCCTT-3'。PCR反应结束后，用溶解曲线分析扩增产物的特异性，以2-△△Ct法分析癌组织中PPFIA1的表达相对于正常对照组织中的变化倍数，以此表示目的基因PPFIA1的相对表达量。
1.4 统计学分析
应用SPSS 22.0软件包进行数据分析，喉鳞癌组织与正常组织对照中PPFIA1 mRNA表达差异用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PPFIA家族成员在头颈部鳞癌中的表达特征
通过检索Oncomine数据库，获得了PPFIA家族成员在HNSCC中的表达特征。在Ginos数据集中，PPFIA1 mRNA表达在头颈部鳞癌（41例）较正常黏膜（13例）高2.252倍（P=1.76E-8），见图1。PPFIA2 mRNA、PPFIA3 mRNA、PPFIA4 mRNA分别在头颈部鳞癌组织与正常对照黏膜组织中表达无显着差异（PPFIA2：-1.468倍，P=0.952；PPFIA3：-1.436倍，P=0.974；PPFIA4：-1.260倍，P=0.917），见图2、3、4。通过RT-PCR检测，PPFIA1 mRNA表达在喉鳞癌组织较喉黏膜正常组织表达显着上调，有统计学意义（P＜0.0001），见图5。
2.2 PPFIA1表达与头颈部鳞癌患者的相关性
通过检索cBioPortal数据库（TCGA，Provisional），收集530例样本PPFIA1基因表达数据，按照表达高低分为高表达组和低表达组，分析PPFIA1 mRNA表达与患者预后的相关性，得出Kaplan-Meier生存曲线。结果显示，PPFIA1 mRNA高表达与低表达的总生存率（OS）有显着差异（P=0.026），见图6。
图2 头颈部鳞癌与正常对照组织中PPFIA2 mRNA表达的差异性（Oncomine 数据库）
图3 头颈部鳞癌与正常对照组织中PPFIA3 mRNA表达的差异性（Oncomine 数据库）
图4 头颈部鳞癌与正常对照组织中PPFIA4 mRNA表达的差异性（Oncomine 数据库）
3 讨论
头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是世界第6大常见的好发肿瘤[9]，据统计，61%的HNSCC患者会出现复发，高达26%的患者发展为远距离转移[10]。尽管HNSCC患者有多种治疗方法：手术、放化疗、靶向治疗、免疫治疗等，但患者5年OS仍不高，为40%，复发和远处转移成为预后差和致死的主要原因[11]。研究表明，HNSCC的发生发展与许多重要的癌基因发生突变及表达异常密切相关[12]。因此，寻找一种分子标志物对评估HNSCC患者预后有非常重要的作用。
PPFIA1基因定位于染色体11q13扩增区，属于LAR蛋白酪氨酸磷酸酶连接蛋白家族。PPFIA1能与LAR蛋白酪氨酸磷酸酶受体在粘着斑处相互作用，增强细胞的移动[13]。PPFIA1在多种恶性肿瘤中都是高表达的。有研究报道，PPFIA1基因在乳腺癌细胞系中细胞的转移和侵袭发挥重要的作用，且与患者预后相关，可作为评估乳腺癌患者的一种潜在分子标志物[4]。PPFIA1蛋白能与ING4相互作用，增强结肠癌细胞的迁移能力，从而促进癌细胞的转移[14]。此外，PPFIA1在不同肿瘤中的功能多样性可能与它相连接的蛋白不同有关[15]。
图5 喉癌和正常喉黏膜组织中PPFIA1 mRNA表达的差异性
图6 PPFIA1表达与HNSCC患者预后的相关性（cBioPortal数据库）
本研究通过挖掘Oncomine数据库分析了PPFIA家族成员分别在头颈部鳞癌和正常对照黏膜的差异性表达，发现PPFIA1在头颈部鳞癌中的表达水平显着高于正常对照黏膜，通过对临床喉癌组织标本的RT-PCR检测，也证实了这一点。而其它家族成员在头颈部鳞癌中的表达水平与正常对照黏膜无明显差异。同时，通过cBioPortal数据库进一步分析发现PPFIA1高低表达与患者预后显着相关，PPFIA1高表达患者，预后较差。因此，在HNSCC中，PPFIA1通过一定的机制影响肿瘤的发生发展。
综上所述，本研究报道了PPFIA1在头颈部鳞癌中的表达显着高于正常对照组织，PPFIA1高表达的患者生存期较短，预后较差。因此有必要进一步研究其作用于肿瘤的机制，对改善患者预后的研究具有一定的理论指导意义。
