甘露菁，邓泽元*
(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，高等研究院，江西 南昌 330047)
响应曲面法优化醇提荷叶复方物超临界萃取残渣中黄酮的工艺
甘露菁，邓泽元*
(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，高等研究院，江西 南昌 330047)
对荷叶复方物超临界萃取后的残渣中黄酮进行醇提，用Box-Behnken响应曲面设计法，以料液比、乙醇体积分数、温度及时间为自变量，以总黄酮得率为响应指标，用回归方程的方差分析检验模型的准确性。修正后最优化的条件为残渣10g时，料液比1:20(g/mL)、乙醇体积分数50%、温度80℃、时间80min。在此条件下总黄酮得率为15.97mg/g，提取3次结果与理论预测值相近。因此，基于Box-Behnken响应曲面法所得的优化提取工艺参数准确可靠，具有实用价值，可用于荷叶复方降脂产品的开发。
响应曲面法；黄酮；残渣
Abstract：Ethanol extraction was employed to extract total flavonoids from the leftover residue of a Chinese herbal medicine combination consisting of lotus leaves, cassia seeds, hawthorn fruit and oriental water plantain rhizome after supercritical carbon dioxide extraction. The optimal conditions for the extraction of total flavonoids were explored by response surface methodology.Box-Behnken design was applied to provide experimental data for establishing a mathematical regression model describing the relationship between the extraction rate of total flavonoids and four independent variables including material-to-liquid ratio,ethanol concentration, extraction temperature and extraction time. Correlation analysis of the established model was performed,and the results indicated that it could be employed to optimize the ethanol extraction of total flavonoids from the start material.Material-to-liquid ratio of 1:20, ethanol concentration of 50%, extraction temperature of 80 ℃ and extraction time of 80 min were found optimum. The experimental values of the extraction rate of total flavonoids under these optimum conditions were in good agreement with the predicted ones.
Key words：response surface methodology；flavonoids；residue
荷叶(主要降脂活性物质生物碱和黄酮)[1-2]多与山楂(Crataegus PinnatifidaBge.)(主要降脂活性物质黄酮)[3]、决明子(Cassia ObtusifoliaL.)(主要降脂活性物质蒽醌)[4]、泽泻(Alisma Orientalis(Sam.) Juzep.)(主要降脂活性物质三萜类)[5]等组成复方，多用于治疗高血脂、高血压及其并发症。前期研究中，将荷叶、山楂、决明子和泽泻以2:2:1:1的比例配成复方，用CO2超临界萃取装置对其进行萃取，经过对压强、温度、夹带剂用量这3个条件进行优化后，一次性萃取生物碱、蒽醌、三萜类物质得率都较为理想，但黄酮的萃取效果欠佳。本实验旨在探索对荷叶复方超临界萃取后的残渣进行后续提取，即醇提条件的优化。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
荷叶复方(荷叶、决明子、山楂、泽泻)超临界萃取后的残渣。
芦丁标准品 中国药品生物制品检定所。所用试剂均为分析纯。
sp-1910uvpc紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 单因素试验
取上述荷叶复方粉末(60目)超临界萃取后的残渣10g，加一定量的相应体积分数乙醇溶液浸泡，在相应温度中水浴加热提取相应的时间，然后离心分离，留取上清液，下层残留物在同样条件下再提取1次，合并提取液。浓缩后用80%乙醇溶液定容为100mL，备用。在其他条件不变的前提下，分别改变料液比[(固定提取温度为60℃，乙醇体积分数80%，提取时间45min，改变料液比(g/mL)为 1:5、1:10、1:15、1:20、1:25)]、乙醇体积分数(固定提取温度为60℃，料液比为1:20，提取时间45min，改变乙醇体积分数为50%、65%、80%、95%)、温度(固定乙醇体积分数65%，料液比为1:20，提取时间75min，改变温度为50、60、70、80℃)及时间(固定提取温度为60℃，乙醇体积分数65%，料液比1:20，改变提取时间为30、45、60、75、90、120min)等4个因素的水平，通过测定总黄酮含量来评价各因素对醇提荷叶复方超临界萃取残渣的影响[6]。
1.2.2 响应曲面法优化黄酮醇提条件
运用SAS 8.00(SAS Institute Inc.)，采用Box-Behnken响应曲面设计法[7]，以料液比、乙醇体积分数、提取温度、提取时间为自变量，以黄酮得率(mg/g原料)为响应指标[8]，设计四因素三水平试验方案，试验因素编码及水平设计见表1。
表1 响应面试验因素编码及水平Table 1 Factors and levels in the response surface design
1.3.3 总黄酮含量检测方法
采用分光光度法[9]，以芦丁为标准品，无水乙醇定容后直接在最大吸收波长360nm处测定吸光度。得回归方程：y=35.135x+0.0004(其中y为总黄酮含量，x为吸光度)，R2=0.9999。精密移取1mL备用提取液，同法测定，根据标准曲线计算总黄酮含量及得率，得率以每克残渣原料中含有总黄酮量(mg)表示，计算公式如下：
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 料液比对醇提残渣黄酮的影响
图1 料液比对总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids
由图1可知，料液比1:5到1:20的范围内，随着其比例减小，总黄酮得率逐渐增加，从11.79mg/g上升到13.13mg/g，但是当料液比到1:25时却下降到12.41mg/g。可能是因为在一定范围内溶剂用量增加有助于黄酮类化合物的浸出，溶剂用量少，提取不太完全，但溶剂用量过大，水浴加热的负荷增大，达到提取完全所需要的时间也增长，使得在有限的时间内对物料的提取不完全[10]。综合考虑后采用料液比1:20。
2.1.2 乙醇体积分数对醇提残渣黄酮的影响
图2 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids
由图2可知，总黄酮得率在乙醇体积分数65%时最高(13.47mg/g)，80%与95%时分别下降到13.13mg/g和8.58mg/g。这可能是由于乙醇体积分数过高时，沸点下降，导致挥发过大，同时一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，与黄酮类化合物竞争，从而导致黄酮类化合物得率下降[10]。因此，最适乙醇体积分数为65%。
2.1.3 时间对醇提残渣黄酮的影响
图3 提取时间对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids
由图3可知，提取时间延长，黄酮的得率也随之增加，当时间超过75min时(13.90mg/g)，时间延长总黄酮得率增加并不明显(90min时13.90mg/g及120min时13.91mg/g)，为了避免设备多余的消耗和成本的增加，将提取时间控制在75min为宜。
2.1.4 温度对醇提残渣黄酮的影响
图4 温度对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids
由图4可知，随温度的升高黄酮得率增加明显，在70℃时达到顶峰(13.99mg/g)，但当温度到80℃时，残渣中黄酮类物质得率反而降低至13.73mg/g。这可能是由于黄酮类物质的溶出率随着温度的升高而增加，但是温度过高接近乙醇沸点时，反而影响醇对黄酮类物质的溶出量[11]。所以提取温度控制为70℃为宜。
2.2 响应曲面试验结果
响应曲面试验设计方案与试验结果见表2。对表2试验数据进行多元回归拟合，得到响应曲面二次多元回归模型方程：Y
式中：Y代表总黄酮得率，而X1、X2、X3、X4分表代表料液比、乙醇体积分数、温度和时间。
表2 Box-Behnken响应曲面设计及结果Table 2 Box-Behnken response surface design matrix and experimental results
表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis for the established regression model
由表3可知模型P=0.002642<0.01，表明模型极显着，失拟项P=0.2143＞0.05不显着，说明该模型拟合程度良好[12]，可以用此模型对荷叶复方物的超临界萃取残渣中黄酮醇提效果进行分析和预测。由回归模型系数显着性检验结果可知，模型的一次项X1(料液比)、X2(乙醇体积分数)、X3(温度)均对残渣中黄酮醇提的线性效应极显着，而X4(时间)不显着；二次项均对残渣中黄酮醇提的曲面效应显着；交互项X1X2、X2X3对残渣中黄酮醇提的曲面效应显着。
模型响应曲面见图5～10。从响应面分析图上形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用。
图5 料液比和乙醇体积分数对总黄酮得率的交互作用的响应曲面Fig.5 Response surface plot showing the interactive effects of materialto-liquid ratio and ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids
图6 料液比和温度对总黄酮得率的交互作用的响应曲面Fig.6 Response surface plot showing the interactive effects of materialto-liquid ratio and extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids
图7 料液比和时间对总黄酮得率的交互作用的响应曲面Fig.7 Response surface plot showing the interactive effects of materialto-liquid ratio and extraction time on the extraction rate of total flavonoids
图8 乙醇体积分数和温度对总黄酮得率的交互作用响应曲面Fig.8 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids
图9 乙醇体积分数和时间对总黄酮得率的交互作用响应曲面Fig.9 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and extraction time on the extraction rate of total flavonoids
图10 温度和时间对总黄酮得率的交互作用的响应曲面Fig.10 Response surface plot showing the interactive effects of extraction temperature and time on the extraction rate of total flavonoids
对模型方程解逆矩阵得残渣中黄酮醇提最佳工艺为：料液比1:19.74，乙醇体积分数50.88%，温度80.75℃，时间80.12min。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化提取条件修正参数：料液比1:20，乙醇体积分数50%，温度80℃，时间80min。用此最佳实验条件重复3次，得到平均总黄酮得率为15.97mg/g。与理论最佳总黄酮得率15.94mg/g一致。因此，基于响应曲面法所得的优化提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。
3 结 论
用响应曲面法建立了荷叶复方物超临界萃取残渣中总黄酮醇提得率与料液比、乙醇体积分数、温度及时间关系的回归模型，经检验证明该模型准确有效，残渣中黄酮醇提的最佳工艺修正参数为料液比1:20、乙醇体积分数50%、温度80℃、时间80min，在此条件下总黄酮得率为15.97mg/g，与理论最佳得率一致。
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Optimization of Ethanol Extraction of Total Flavonoids from the Leftover Residue of a Chinese Herbal Medicine Combination after Supercritical Carbon Dioxide Extraction Using Response Surface Methodology
GAN Lu-jing，DENG Ze-yuan*
(Institute for Advanced Study, State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University,Nanchang 330047, China)
O623.54
A
1002-6630(2010)18-0026-05
2009-12-16
江西省自然科学基金项目(2006GY0066)；江西省教育厅科研课题(20030058)
甘露菁(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为营养与食品卫生学。E-mail：closer00@foxmail.com
*通信作者：邓泽元(1963—)，男，教授，博士，研究方向为脂肪酸及天然产物。E-mail：dengzy28@yahoo.com.cn
