赵 强，钟红兰，熊 华*，史苏华，邓 波，李 薇
米肽-葡萄糖湿法接枝反应产物的功能性质
赵 强，钟红兰，熊 华*，史苏华，邓 波，李 薇
(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)
以米渣为原料制备的米肽与葡萄糖进行湿法接枝反应，考察影响反应产物功能性质(乳化及乳化稳定性、抗氧化性)的4种因素。结果表明：随着反应温度和反应时间的增加，产物接枝度、褐变度增大，抗氧化性增强，时间过长则接枝度、乳化性及乳化稳定性逐渐降低；随着反应起始pH6～10升高，米肽和接枝产物的乳化性均增加，抗氧化性和乳化稳定性先增后减，且产物的乳化性和抗氧化性均大于米肽，pH值为8时接枝产物还原力达0.798；随着反应底物质量浓度增加，米肽和接枝产物的乳化性均呈现先增后减的趋势，乳化稳定性有明显提高，抗氧化性增强；米肽和葡萄糖质量比对产物的乳化性作用明显，其质量比为1:2时乳化性提高最显着，提高幅度达35.13%；其质量比对产物的抗氧化性影响不明显。
米肽；接枝反应；乳化性；抗氧化性
采用蛋白-多糖的接枝反应，即基于蛋白的氨基端与多糖的羰基还原端之间发生的美拉德反应，可以改善蛋白质溶解性、热稳定性、乳化性、抗氧化活性以及抗变应原性等功能性质[1-2]。美拉德反应又称为“非酶褐变反应”，研究表明美拉德反应产物亦即蛋白-还原糖接枝物具有很好的抗氧化和乳化性能[3-4]。近年来，国内外研究对蛋白-多糖的反应产物的功能性质的报道越来越多[4-6]，已成为食品营养与蛋白质化学领域的热门课题，旨在将其应用于食品体系来提高产品的抗氧化稳定性。
植物水解蛋白是一类通过酸、碱或酶水解大豆、小麦、玉米等植物蛋白得到含有大量多肽、游离氨基酸的蛋白混合物[7]，其来源广泛、价格低廉、溶解性优良和营养价值较高，在食品生产中应用前景广阔，主要是作为原料制备美拉德反应型肉味香精[8]，或作为提升食品感官和营养品质的添加成分。
米肽是大米蛋白的酶法水解物，具有抗氧化[9]、抑制ACE活性[10]等功能，但由于酶解产生了大量的短肽，乳化性和稳定性大大降低[11]，直接影响了食品品质。本研究以酶法制备米肽，选用葡萄糖作为糖供体，采用湿法接枝反应制备米肽-葡萄糖接枝产物，考察反应条件对乳化性、乳化稳定性及抗氧化性的影响，并比较接枝前后性质的变化，旨在探讨米肽与葡萄糖之间发生的接枝反应，改善米肽的功能性质，为其工业化应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
米渣(蛋白质含量(59.61±0.91)%) 江西恒天实业有限公司。
胰蛋白酶(酶活力4000U/g) 无锡市酶制剂厂；2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)、十二烷基磺酸钠(SDS) 美国Sigma公司；葡萄糖、三氯乙酸、三氯化铁、铁氰化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等均为化学分析纯。
1.2 仪器与设备
T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；BS224S万分天平、PB-10型pH计 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；TDL-5型离心机 上海安亭科学仪器厂；HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；RH basic 1磁力搅拌器 德国IKA公司；FSH-Ⅱ型高速电动匀浆器 江苏金坛市环宇科学仪器厂；KDY- 9820凯氏定氮仪 厦门精艺兴业科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 米肽的制备
米肽的制备按照本课题组已报道的方法进行[12]，控制水解度＜10%；米肽蛋白质含量＞85%，产率≥33%；短肽含量占米肽中总蛋白质含量的74.27%，其中93%短肽的分子质量小于10kD，近70%短肽分子质量范围为5kD＞MW＞1kD。
1.3.2 米肽-葡萄糖接枝物制备
工艺流程：米肽粉+葡萄糖→加水溶解→调节pH值→加热→冷却→接枝物(4℃冷藏)
准确称取1g米肽粉和0.5g葡萄糖(即按照质量比2:1)，加入去离子水配成质量浓度1g/100mL的米肽溶液，用0.1mol/L的NaOH和HCl调节到所需的pH值，分别在70、80、90℃水浴中加热，每组3个平行，分别在反应后0、0.5、1.0、1.5、2.0h取出反应液10mL置于试管中，立即冰浴冷却10min，所得透明反应液即接枝产物，于4℃冷藏待测。
1.3.3 米肽-葡萄糖产物接枝度(degree of graft，DG)的测定
参照文献[13]中的TNBS法略作改进。取0.125mL接枝物溶液，加入5mL 0.1g/100mL SDS，涡旋振荡混匀，从中取0.250mL加入到盛有2mL PBS缓冲液(0.05mol/L，pH8.2)的试管中，再加入1mL 0.1g/100mL TNBS溶液，涡旋振荡混匀，在50℃水浴中避光反应1h，然后取出加入2mL 0.1mol/L HCl终止反应，室温下放置30min，于340nm波长处测定吸光度。按式(1)计算接枝度。
式中： A0为接枝反应前样品的吸光度；At为反应t时刻后样品的吸光度。
1.3.4 接枝物褐变度的测定[14]
取0.125mL接枝物溶液，加入5mL 0.1g/100mL SDS溶液，涡旋振荡混匀，在420nm波长处测定吸光度，以0.1g/100mLSDS溶液做空白对照。
1.3.5 接枝物乳化性及乳化稳定性的测定
采用浊度法[15]，稍作改进：取16mL接枝物溶液与4mL大豆油混合，在10000r/min条件下高速剪切乳化1min，用微量进样器准确量取容器底部0.5cm处50μL的乳化液，加入到5mL 0.1g/100mLSDS溶液中混合均匀，即时测定500nm波长处的吸光度A0表示乳化性(emulsifying activity，EA)，以0.1g/100mLSDS做空白对照。静置10min后重新取样测定吸光度At，则乳化稳定性(emulsifying stability，ES)可表示为：
式中：Δt为两次测定乳化活性的时间间隔，本实验中该值为10min。
1.3.6 接枝物抗氧化性的测定
接枝反应产物的抗氧化效果与其还原力密切相关。还原能力大的样品是良好的电子供体，其供应的电子能使Fe3+还原成Fe2+，同时能与自由基反应，中断自由基的连锁反应使自由基成为较为稳定的物质[16]。还原力越强，抗氧化性越强，因此可通过测定还原力来说明抗氧化活性的强弱。
还原力测定方法[17]如下：取lmL接枝物溶液于具塞的离心管中，加入2.5mL PBS缓冲液(0.2mol/L，pH6.6)和2.5mL 10g/100mLK3Fe(CN)6溶液，混合均匀，50℃水浴保温20min后待冷却后加入2.5mL 10g/100mL三氯乙酸溶液，混匀后3000r/min离心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1g/100mLFeCl3，涡旋振荡混匀，静置10min后测定700nm波长处的吸光度，吸光度越大，样品的还原能力越大，亦即抗氧化性越强。
2 结果与分析
2.1 米肽-葡萄糖接枝反应
蛋白质-还原糖的接枝反应，主要通过测定接枝度和褐变度。在米肽质量浓度10mg/mL、米肽和葡萄糖质量比2:1、pH7.0的反应条件下，考察不同反应温度和反应时间下的米肽-葡萄糖(peptides-glucose，P-G)接枝物接枝度和褐变度的变化。结果见图1。
图1 不同反应温度和反应时间的米肽-葡萄糖接枝物褐变度和接枝度Fig.1 Plots of browning degree and DG of GRPs obtained at different temperatures versus reaction time
从图1A、B可以看出，反应温度升高，反应时间延长有利于米肽-葡萄糖接枝反应的进行。在90℃、反应1h时接枝度最大，达39.62%；90℃、2h时体系的褐变程度最高；但温度为80℃和90℃时、时间超过1h后，接枝度均略有下降，原因可能是反应进入到后期阶段，接枝物可逆降解、或进一步聚合等反应所造成。
2.2 米肽-葡萄糖接枝物的乳化性(EA)及乳化稳定性(ES)
2.2.1 反应温度和反应时间对米肽-葡萄糖接枝物乳化性及乳化稳定性的影响
在米肽质量浓度10mg/mL、米肽和葡萄糖质量比2:1、 pH7.0的反应条件下，研究不同反应温度和反应时间对P-G接枝物的乳化性及乳化稳定性的影响，结果见图2A、B。
图2 不同反应温度和反应时间的米肽-葡萄糖接枝物乳化性和乳化稳定性Fig.2 Plots of EA and ES of GRPs obtained at different temperatures versus reaction time
由图2A可知，反应温度升高，米肽接枝葡萄糖接枝物的乳化性有所减小；而同一温度下随时间延长接枝物的乳化性先增加后减小；在70℃反应1.5h时接枝物乳化性达到最大值0.498。原因可能是米肽接枝上葡萄糖，增加了米肽的疏水性，同时在反应条件较为温和的70℃反应1.5h时反应体系疏水-亲水性达到了平衡；另一方面，随温度升高反应程度加剧，1h即达到最大的接枝度(图1B)，反应体系pH值下降很快，导致乳化性随温度增加有所减小。由图2B可知，接枝物的乳化稳定性随时间增加是下降的，到1.5h时趋于稳定，反应温度为80℃时下降最明显。
2.2.2 反应起始pH值对米肽和米肽-葡萄糖接枝物乳化性及乳化稳定性的影响
在温度80℃、时间1h、米肽质量浓度10mg/mL，米肽和葡萄糖质量比2:1的反应条件下，研究反应起始pH值对P-G接枝物乳化性和乳化稳定性的影响，结果见图3。
图3 不同起始反应pH值条件下接枝反应前后米肽和米肽-葡萄糖接枝物的乳化性和乳化稳定性Fig.3 EA and ES of rice peptides before and after grafting with glucose at different initial pHs
由图3A可知，pH值升高，米肽和米肽-葡萄糖接枝物的乳化性均增加，且与不加糖的肽相比，在不同的起始反应pH值下接枝物的乳化性均得到显着改善(P＜0.05)。这除了与pH值升高溶解性增加有关外，还因为在碱性条件下，由于－OH的作用，使—COOH增多，增加了分子间的静电斥力，使离散双电层加厚，溶液界面膜加厚，同时有利于胶束的形成，因此乳化活性得到提高。由图3B可知，米肽和P-G接枝物的乳化稳定性均是先增后减，在起始pH6、7、8时均显示米肽比P-G接枝物的乳化稳定性更好，但在pH9、10时则是P-G接枝物的乳化稳定性强于米肽。
2.2.3 底物质量浓度对米肽和米肽-葡萄糖接枝物乳化性及乳化稳定性的影响
在温度80℃、时间1h、米肽和葡萄糖质量比2:1、pH7的反应条件下，考察底物质量浓度(3、6、9、12、15mg/mL)对接枝物乳化性和乳化稳定性的影响，结果见图4。
图4 不同底物质量浓度接枝反应前后米肽和米肽-葡萄糖接枝物的乳化性和乳化稳定性Fig.4 EA and ES of rice peptides before and after grafting with glucose at different substrate concentrations
由图4A可知，随着底物质量浓度的增大，米肽和P-G接枝物的乳化性均先增加后减小；P-G接枝物的乳化性并没显着改善，但是质量浓度为9mg/mL和12mg/mL时乳化稳定性有明显的提高(图4B)(P＜0.05)。原因可能是浓度较低时，增大质量浓度则参与乳化的肽增多，乳化性增强，但质量浓度达到一定程度时，溶液黏度上升，分子流动性变差，影响了P-G接枝物反应，接枝度降低，导致乳化性降低。
2.2.4 米肽-葡萄糖质量比对米肽和米肽-葡萄糖接枝物乳化性及乳化稳定性的影响
在温度80℃、时间1h、米肽质量浓度10mg/mL、pH7的反应条件下，考察米肽和葡萄糖质量比对P-G接枝物乳化性和乳化稳定性的影响，结果见图5。
图5 不同米肽和葡萄糖质量比条件下接枝反应前后米肽和米肽-葡萄糖接枝物的乳化性和乳化稳定性Fig.5 EA and ES of rice peptides before and after grafting with glucose at rice peptide/glucose mass ratios
由图5A可知，米肽和葡萄糖质量比对P-G的乳化性作用明显，米肽和P-G接枝物的乳化性都随米肽与葡萄糖质量比的下降先增加后减小，接枝反应后的乳化性均有提高，在米肽和葡萄糖质量比为1:2时乳化性提高幅度最大，达35.13%。图5B表明乳化稳定性则呈现先减后增的趋势，P-G接枝物的乳化稳定性除了质量比为1:2时稍有增加，其余都减小。原因是葡萄糖量过多反而会影响溶液的黏度和分子流动性，继而影响P-G接枝物反应，接枝度降低，从而影响乳化性。
2.3 米肽-葡萄糖接枝物的抗氧化性
2.3.1 反应温度和反应时间对米肽-葡萄糖接枝物还原力的影响
在米肽质量浓度为10mg/mL、米肽和葡萄糖质量比为2:1、pH7的条件下，不同反应温度和反应时间对P-G接枝物还原力的影响，结果见图6。
图6 不同反应温度和反应时间的P-G接枝物还原力Fig.6 Plots of reducing power of GRPs obtained at different temperatures versus reaction time
由图6可知，还原力的变化与图1中反应温度和时间对褐变度的影响曲线有一致性。温度升高，褐变度增加，P-G中类黑素[18]浓度增加，抗氧化性增强。马志玲等[19]的研究也得出同样的结论，产生类黑素的同时，有一系列的美拉德反应中间体-还原酮类物质及杂环类化合物生成，这些产物对抗氧化性也有一定的贡献作用。
2.3.2 反应起始pH值对米肽-葡萄糖接枝物还原力的影响
在温度80℃、时间1h、米肽质量浓度10mg/mL、米肽和葡萄糖质量比2:1的反应条件下，研究起始反应pH值对P-G接枝物还原力的影响。结果见图7。
图7 不同起始反应pH值条件下接枝反应前后米肽和P-G接枝物的还原力Fig.7 Reducing power of rice peptides before and after grafting with at different initial pHs
由图7可知，米肽和P-G接枝物的抗氧化性均随pH值的升高先增加后减小，接枝后的抗氧化性要明显大于接枝前，pH8时米肽和米肽-葡萄糖接枝物的还原力最大，达0.798，但整体看在pH6～10范围内，起始反应pH值对抗氧化性的影响不显着(P＞0.5)。
2.3.3 底物质量浓度对米肽-葡萄糖接枝物还原力的影响
在温度80℃、时间1h、米肽和葡萄糖质量比2:1、pH7的反应条件下，研究底物质量浓度对P-G接枝物还原力的影响，结果如图8所示。随着底物质量浓度的增大，P-G接枝物的还原力显着增加，原因主要是反应过程随着米肽质量浓度增大，自身的抗氧化性在增强。
图8 不同底物浓度接枝反应后P-G接枝物的还原力Fig.8 Reducing power of rice peptides before and after grafting with at different substrate concentrations
2.3.4 米肽-葡萄糖质量比对还原力的影响
在反应温度80℃、时间1h、米肽质量浓度10mg/mL、pH7的条件下，研究米肽-葡萄糖的质量比对P-G还原力的影响，结果见图9。当质量比为1:1时，P-G的还原力最大，但还原力并未因为其质量比的改变出现明显的变化，说明质量比对其影响不显着。
图9 不同米肽和葡萄糖质量比条件下接枝反应后P-G接枝物的还原力Fig.9 Reducing power of rice peptides before and after grafting with at different rice peptide/glucose mass ratios
3 结 论
米肽-葡萄糖接枝反应随反应温度升高、时间延长，产物接枝度和褐变度增大，其抗氧化性增强；时间过长则接枝度、乳化性及乳化稳定性逐渐降低；反应起始pH值升高，米肽和接枝产物的乳化性均增加，抗氧化性和乳化稳定性随反应时间先增后减，接枝产物乳化性和抗氧化性增加幅度明显高于米肽；随着反应底物浓度增加，米肽和接枝产物的乳化性均呈现先增后减的趋势，乳化稳定性有明显提高，抗氧化性增强；米肽和葡萄糖质量比对产物的乳化性作用明显，质量比为1:2时乳化性提高最显着，达35.13%，但米肽-葡萄糖的质量比对产物的抗氧化性影响不明显。
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Functional Properties of Products of a Grafting Reaction between Rice Peptide and Glucose in Aqueous Solution
ZHAO Qiang，ZHONG Hong-lan，XIONG Hua*，SHI Su-hua，DENG Bo，LI Wei
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)
Rice peptides were grafted with glucose in aqueous solution under different levels of reaction temperature and time, initial pH, substrate concentration, rice peptide/glucose mass ratio in order to investigate the effects of these reaction conditions on the functional properties of the grafted products including emulsifying activity (EA), emulsion stability (ES) and reducing power. The results indicated that 1) the degree of grafting (DG), browning degree and reducing power of the graft reaction products (GRPs) increase with rising reaction temperature and prolonged reaction time. However, excessively long reaction time led to decreases in DG, EA and ES; 2) The EAs of rice peptides and GRPs were both enhanced as initial pH increased from 6 to 10, their reducing power and ES increased initially and then decreased, and GRPs showed higher levels of EA and reducing power than native rice peptides, and GRPs obtained using an initial pH of 0.798 had the highest reducing activity; 3) both the EAs of rice peptides and GRPs showed a trend to initially increase and then decrease with substrate concentration increased, and the emulsify stability and reducing power were improved remarkably; 4) The EA and ES of GRPs were obviously affected by rice peptide/glucose mass ratio, and EA was most significantly enhanced and reached up to 35.13% when the ratio was 1:2, while the ratio had no significant effect on the reducing power of GRPs.
rice peptide；grafting reaction；emulsifying activity；antioxidant activity
TS201.1
A
1002-6630(2010)19-0115-06
2010-06-30
食品科学与技术国家重点实验室目标导向资助项目(SKLF-MB-200809)；食品科学与技术国家重点实验室自由探索资助项目(SKLF-TS-200818)；科技部科技人员入园入企项目(SQ2009GJC5005767)；2009年江西省研究生创新资金项目
赵强(1981—)，男，博士研究生，研究方向为功能性食品。E-mail：zqvzys811221@yahoo.com.cn
*通信作者：熊华(1957—)，男，教授，硕士，研究方向为功能食品与食品微胶囊技术。E-mail：huaxiong100@yahoo.com.cn
