董华强，甄畅迪，张 毅，李 梅，刘富来，黄剑波
南山楂叶黄酮抑制α-葡萄糖苷酶和清除DPPH自由基的作用
董华强1，甄畅迪1，张 毅2，李 梅1，刘富来1，黄剑波1
(1.佛山科学技术学院食品科学系，广东 佛山 528231；2.华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510641)
目的：研究南山楂叶黄酮提取物(SZ)对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用和抗氧化活性。方法：检测SZ对来源于酵母菌的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，并采用Lineweave-Burk双倒数曲线研究其抑制机理；测定SZ对DPPH自由基的清除率，考察其抗氧化活性。结果：SZ对α-葡萄糖苷酶的抑制率可达到64.3%，属于非竞争性抑制；对DPPH自由基的清除率可达52.8%，IC50值为0.57mg/mL。结论：SZ对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用和具有一定的抗氧化活性。
南山楂叶；黄酮；α-葡萄糖苷酶；抑制作用；抗氧化
山楂为蔷薇科植物山里红(C. pinnatifida Bunge var. major N. E. Br.)、山楂(C. pinnatifida Bge)或野山楂(C. cuneata Sieb. et Zucc.)的干燥成熟果实。前两种习称北山楂，后一种习称南山楂。除了果实，山楂叶也可入药，用于活血化淤，理气通脉[1]。2005年版《中国药典》也正式收载山楂叶。近年来，用山楂治疗心血管方面疾病的研究较多。叶希韵等[2-4]研究表明，山楂叶黄酮对防治糖尿病及其并发症有积极的作用。1990年版中国药典一部未将南山楂收入[5]，对南山楂的研究报道也很少。一些学者对此有不同看法，虞人荣[6]甚至认为南山楂的治疗作用优于正品山楂。
α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.20)是位于小肠黏膜上的寡糖水解酶，与餐后血糖水平升高密切相关[7]。阿卡波糖(acarbose)是临床上广泛应用的控制餐后血糖的有效药物，其药效机理就是抑制小肠黏膜的α-葡萄糖苷酶活性[8]。由于阿卡波糖存在明显的副作用[9-12]，人们一直在寻找天然无副作用的α-葡萄糖苷酶抑制剂[13-15]。有报道从植物中提取分离得到一些天然α-葡萄糖苷酶抑制剂，没有阿卡波糖等药物的副作用[16]。本实验对南山楂叶黄酮提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
南山楂(C. cuneata Sieb. Et Zucc.)干叶购于广东阳山县城。
α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)、DPPH、对硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷 美国Sigma公司；阿卡波糖(acarbose) 德国拜耳公司；95%乙醇、甲醇、乙酸乙酯均为分析纯 上海化学试剂厂；茶多酚(TP，含量70%)、芦丁(含量95%) 上海同田生物技术有限公司。1.2仪器与设备
UV-260紫外-可见分光光度仪 日本岛津公司；M2e 酶标仪(micro-plate reader) 美国Molecular device公司；HH数显恒温水浴锅 金坛市金城国胜实验仪器厂；TGL-16台式离心机 长沙市平凡仪器仪表有限公司；旋转真空蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 南山楂叶黄酮提取
称取南山楂叶40g，粉碎后移入圆底烧瓶，加入500mL 80%乙醇溶液，置于75℃水浴锅中回流2h，过滤并收集滤液。重复3次，合并滤液，挥干，得到粗提物。称取粗提物约5g，用50mL的20%乙醇溶液溶解后，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并两次乙酸乙酯层萃取液，挥干，得到南山楂叶黄酮提取物(SZ)。黄酮提取率和提取物的黄酮纯度分别按式(1)、(2)计算：
式中：m1为南山楂叶黄酮提取物中黄酮质量/g；m0为南山楂叶中黄酮质量/g；mz为南山楂叶黄酮提取物质量/g。
1.3.2 黄酮含量测定
1.3.2.1 标准曲线的绘制
取0.05g芦丁，充分溶解于50mL无水乙醇，分别取溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，加蒸馏水定溶至5mL制成梯度浓度。在波长260nm处测定吸光度(A260nm)；以芦丁质量浓度(ρ)为横坐标、A260nm为纵坐标作标准曲线，得回归方程：A260nm=5.623ρ＋0.2203，r＝0.9897。
1.3.2.2 样品黄酮含量测定
测定样品液的A260nm值，根据公式A260nm=5.623ρ+ 0.2203，计算出样品黄酮含量。
1.3.3 α-葡萄糖苷酶活性测定
参照文献[17]的方法，略作修改。取60μL待测液于96孔酶标板中，加入50μL α-葡萄糖苷酶溶液，摇匀后于37℃水浴保温10min，50μL PNPG溶液摇匀，在37℃水浴中反应20min，加入160μL Na2CO3溶液中止酶促反应，置于405nm波长处测吸光度。由于SZ本身有颜色，因此每个样品需要测定背景吸收，并对最终测定结果进行校正。每个样品重复3次取平均值。抑制率按式(3)计算。
式中：Aj为样品组吸光度；A0为空白对照组吸光度。
采用Lineweaver-Burk作图法，对SZ抑制α-葡萄糖苷酶活性的机理进行分析。
1.3.4 清除DPPH自由基能力测定
参照文献[17]方法，略作修改。以甲醇为溶剂，配制不同质量浓度的样品溶液，吸取50μL待测液于96孔酶标板中，加入150μL DPPH溶液，摇匀，25℃条件下避光静置30min，于波长517nm处测定吸光度。按式(4)计算DPPH自由基清除率。
式中：Q为DPPH自由基清除率；A0为不加试样DPPH溶液的吸光度；At为加试样反应后 DPPH 溶液吸光度。
以清除DPPH自由基达到稳定态50%清除率所需加入样品的质量浓度为IC50，用以表示其抗氧化能力。
2 结果与分析
2.1 南山楂叶提取物的黄酮含量
按照前述黄酮提取分离和测定方法，得到SZ的黄酮含量为3.35%，纯度为58.2%，提取率为86.9%。
2.2 SZ对α-葡萄糖苷酶活性的抑制
图1 SZ对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.1 α-glucosidase inhibiting effect of the flavonoid-rich extract studied using acarbose and tea polysaccharide as the controls
由图1可知，阳性对照阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用很强，而SZ对α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用也很明显，茶多酚对α-葡萄糖苷酶活性也有一定抑制作用，但抑制率很低。在0.01～0.3mg/mL质量浓度范围内，SZ对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用呈一定量效关系，抑制效果随SZ质量浓度的增加相应增强，在0.3mg/mL时抑制率达到64.3%。
2.3 南山楂叶黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制机理
以不同质量浓度(0.2mg/mL和0.5mg/mL)SZ作为抑制剂，测定不同底物质量浓度α-葡萄糖苷酶酶促反应速率(V)，以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标作Lineweave-Burk双倒数曲线，结果如图2所示。
图2 南山楂黄酮提取物抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweave-Burk双倒数曲线Fig.2 Lineweaver-Burk plot of inhibitory effect of the flavonoid-rich extract onα-glucosidase
由图2可见，两条不同质量浓度的SZ的Lineweave-Burk双倒数曲线相交于X轴的负值区，呈现出较典型的非竞争性抑制剂特征，反应速率随抑制剂质量浓度增大而变小，米氏常数保持不变，说明SZ对α-葡萄糖苷酶的抑制作用属于非竞争性抑制。
2.4 南山楂叶黄酮提取物对DPPH自由基的清除效果
2.4.1 SZ清除率随时间的变化
图3 SZ对DPPH自由基的清除率随时间的变化曲线Fig.3 Time courses of DPPH free radical scavenging effect of the flavonoid-rich extract and vitamin C
由图3可见，SZ对DPPH自由基的清除率随时间的延长而逐渐增大，在开始反应30min后，对DPPH自由基的清除率达到最大值51.5%。而VC对DPPH自由基的清除率在反应后20min已接近最大值，达到78.3%。说明在本实验体系中，SZ具有一定的抗氧化能力，但清除DPPH自由基的速率比VC慢。
2.4.2 不同质量浓度SZ对DPPH的清除率和IC50值
由图4可知，在0.1～1.2mg/mL范围内，SZ对DPPH自由基的清除率随质量浓度的增大而增大，呈现一定的量效关系，在1.2mg/mL时达到最大值52.8%，IC50值为0.57mg/mL。而VC在0.6mg/mL时清除率达到84.5%， IC50值为0.28mg/mL。可见，SZ具有一定的抗氧化活性。但无论最大抗氧化能力和达到一半最大抗氧化能力所需的质量浓度(IC50值)，都不如VC。
图4 不同质量浓度SZ、VC对DPPH自由基的清除率Fig.4 Concentration dependence of DPPH free radical scavenging effect of the flavonoid-rich extract and vitamin C
3 结 论
3.1 SZ对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制活性，抑制率可达到64.3%，抑制机理属于非竞争性抑制。
3.2 SZ具有明显的清除DPPH自由基能力，清除率可达52.8 %，IC50值为0.57mg/mL。
综上所述，SZ对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制活性，并具有一定的抗氧化能力，具有很好的抗糖尿病活性开发潜力，值得进一步深入研究。
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Alpha-glucosidase Inhibiting Effect of DPPH free Radical Scavenging Activity of Flavonoid-rich Extract from Leaves of Crataegus cuneata Sieb. et Zucc
DONG Hua-qiang1，ZHEN Chang-di1，ZHANG Yi2，LI Mei1，LIU Fu-lai1，HUANG Jian-bo1
(1. Department of Food Science, Foshan University, Foshan 528231, China；2. College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China)
A flavonoid-rich extract obtained by ethyl acetate extraction from the 80% ethanol extract from the leaves of Crataegus cuneata Sieb. et Zucc was evaluated for its alpha-glucosidase inhibiting effect and DPPH free radical scavenging activity. The extract had an inhibitory effect on alpha-glucosidase derived from yeast, and the maximum inhibitory rate was up to 64.3%, and the inhibition was uncompetitive according to the Lineweaver-Burk plot. The maximum DPPH free radical scavenging rate of the extract was up to 52.8%, and the IC50 was 0.57 mg/mL. In conclusion, the extract had strong ability to inhibit yeast-derived alphaglucosidase and certain antioxidant activity.
leaves Crataegus cuneata Sieb. et Zucc；flavonoids；alpha-glucosidase；inhibiting effect；antioxidation
TS201.2
A
1002-6630(2010)19-0179-03
2010-07-05
广东省自然科学基金项目(8152800001000023)
董华强(1958—)，男，教授，博士，研究方向为农产品贮藏与加工、食品功能性成分化学与活性评价。E-mail：huaqiangdong@163.com
