许审时，马海乐,2,*
(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013，2.江苏省农产品生物加工与分离工程技术研究中心，江苏 镇江 212013)
金黄色葡萄球菌脉冲磁场杀菌实验、生物学窗效应及其失活动力学
许审时1，马海乐1,2,*
(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013，2.江苏省农产品生物加工与分离工程技术研究中心，江苏 镇江 212013)
以金黄色葡萄球菌为对象，研究磁场强度、脉冲数和样品温度对杀菌效果的影响。结果发现：随磁场强度的增加，金黄色葡萄球菌残留率总体呈下降趋势，其中磁场强度3.5T时杀菌效果最好；活菌残留率随脉冲数的增加而降低，在20个脉冲数时达到最低，之后残留率趋于稳定；温度对杀菌效果有一定的协同促进作用。研究得到了脉冲磁场杀菌的最优条件为：磁场强度3.5T、脉冲数20个、样品温度30℃，此条件下金黄色葡萄球菌残留率为7.29%。在本实验中，金黄色葡萄球菌ATCC25923的脉冲磁场杀菌效果表现出生物学窗效应：脉冲数的窗值为20；当脉冲数为20时，磁场强度的窗值IW符合如下递推关系：IW(n)=n(9－n)/4－1(n为“强度窗”的出现序次，n=1、2、3)。通过分析Gelow模型、Weibull模型和Hulsheger模型决定系数(R2)表明，Gelow模型最好地拟合了脉冲磁场作用下金黄色葡萄球菌残留率动力学变化。
脉冲磁场；金黄色葡萄球菌；杀菌；窗效应；动力学
Abstract：The sterilization effect of pulsed magnetic field treatment onStaphylococcus aureuswas examined under different levels of field intensity, pulse number and bacterial suspension temperature. As field intensity increased, the residual survival rate ofStaphylococcus aureusgenerally tended to decrease and the best sterilization effect was observed at a filed intensity of 3.5 T. The effect of pulse number on the residual survival rate of this strain was similar to that of field intensity, and the residual survival rate of this strain reached its minimum after 20 pulses were completed, and then tended to be unchanged with increasing pulse number. Additionally, environmental temperature had a synergistic promoting effect on the inactivation ofStaphylococcus aureus. The above results demonstrate that the optimal levels of field intensity, pulse number and bacterial suspension temperature for sterilizingStaphylococcus aureuswere 3.5 T, 20 and 30℃, respectively. The percentage of residual viable cells was 7.29%under these conditions. The sterilization of pulsed magnetic field onStaphylococcus aureusdisplayed a biological window effect.The window value of field intensity under 20 pulse number and 20 window value of pulse number accorded with the following recurrence formula:IW(n)=n(9－n)/4－1 (nis appearing sequence of the window value of field intensity,n=1, 2 and 3). The comparative analysis of correlation coefficients (R2) of the Gelow, the Weibull and the Hulsheger models indicates that the Gelow model is the best model describing the dynamic change of percentage of residual viableStaphylococcus aureuscells during pulsed magnetic field treatment.
Key words：pulsed magnetic field；Staphylococcus aureus；sterilization；biological window effect；dynamics model
目前，食品工业中主要的杀菌方式是热杀菌，如传统的巴氏杀菌、高温短时、超高温等杀菌技术。但大多热杀菌技术存在破坏食品色泽、滋味及功能等问题，既能保证食品安全又能保持固有的营养成分的非热杀菌技术已成为食品工业的研究热点，大量研究表明，脉冲磁场技术杀菌效果显着，是一种有前途的非热杀菌技术[1-5]，不过脉冲磁场杀菌技术的机理研究还非常欠缺。为此，本实验以食品中常见的金黄色葡萄球菌为研究对象，研究杀菌操作参数对金黄色葡萄球菌杀灭效果的影响，进一步探讨脉冲磁场(pulsed magnetic field，PMF)杀菌的生物学窗效应、研究动力学模型。
1 材料与方法
1.1 菌种
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus)ATCC25923由中国微生物研究所提供。
1.2 仪器与设备
脉冲磁场杀菌设备 自行研制(专利号ZL0322055111)；LZ- 610H型特斯拉计 湖南娄底市联众科技有限公司；WFJ7200型分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司；SPX-250B型生化培养箱 常州国华电器有限公司；QYC-211型恒温培养摇床 上海福玛试验设备有限公司；YX1400Z型电热蒸汽压力消毒器 上海三申医疗器械有限公司；SHZ-88A型恒温水浴振荡器 太仓市试验设备厂。
1.3 方法
1.3.1 菌落总数测定
参照GB/T 4789.12—2003《食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验》进行。
1.3.2 金黄色葡萄球菌生长曲线测定
参照文献[6]进行。
1.3.3 脉冲磁场杀菌
脉冲磁场杀菌设备场度范围为0.66～4.0T。磁场强度可通过调节充电电压进行调节，并用特斯拉计进行测量。杀菌时将菌液放入杀菌室内，接通电源，调整电压到需要值，进行充电，当电容两端电压达到规定的放电电压时，进行放电，完成一个脉冲数的杀菌。之后让脉冲磁场发生器停止工作30s，以削弱焦耳热导致螺旋线圈的温度升高，然后再进行下一次的杀菌实验。完成杀菌处理后，取出样品，将菌液摇匀后进行杀菌效果的检验。
每一次实验取1mL菌液，保持初始菌液中金黄色葡萄球菌的菌浓在106～107CFU/mL之间，将菌液加入盛有9mL生理盐水的离心管中，将离心管放入杀菌室进行杀菌处理。
1.3.4 杀菌效果检验
采用平板菌落计数法统计金黄色葡萄球菌残留率来检测杀菌效果。金黄色葡萄球菌残留率按式(1)计算。
式中：N为杀菌后菌液中金黄色葡萄球菌数；N0为杀菌前菌液中金黄色葡萄球菌数。
根据公式计算得出的残留率研究金黄色葡萄球菌生长时期、磁场强度、脉冲数及样品温度对脉冲磁场杀菌效果的影响。
1.3.5 金黄色葡萄球菌杀菌动力学模型
受脉冲磁场处理，金黄色葡萄球菌活性变化的动力学过程用Gelow模型[7]、Weibull模型[8]和Hulsheger模型[9]进行拟合。
式中：S=N/N0，N0和N分别是PMF处理前后活菌的数量/(CFU/mL)；t为处理时间/s，在本实验中用脉冲数代表；D为十进制减少时间。
式中：bt为回归系数；tc为PMF处理的临界时间，本实验中为临界脉冲数；t为处理时间/s，在本实验中用脉冲数代表。
式中：a和b分别是比例因子(scale factor)和形状因子(shape factor，b＜1时存活率曲线呈凹形，b＞1时存活率曲线呈凸形，b=1时存活率曲线呈线性)；t为处理时间，在本实验中用脉冲数代表。
2 结果与分析
2.1 金黄色葡萄球菌脉冲磁场杀菌效果的研究
2.1.1 金黄色葡萄球菌生长时期对杀菌效果的影响
图1 金黄色葡萄球菌的生长曲线Fig.1 Growth curve ofStaphylococcus aureus
如图1所示，金黄色葡萄球菌在培养时间0～1.5h为延迟生长期，1.5～16h为对数生长期，从16h起进入稳定生长期与衰亡期。课题组的相关实验研究表明，处于对数生长期的微生物对高强度脉冲磁场辐射最为敏感[2]，尤其是对数生长期的中期，因此后续实验采用的金黄色葡萄球菌都是处于对数生长期中期8h的菌株。
2.1.2 磁场强度对杀菌效果的影响
图2 磁场强度对脉冲磁场杀菌效果的影响Fig.2 Effect of magnetic field intensity onStaphylococcus aureusinactivation
在脉冲数分别为10、20、30，样品温度30℃，pH7.0的条件下，不同磁场强度对杀菌效果的影响如图2所示。在不同的脉冲数下，随着磁场强度增加，金黄色葡萄球菌的活菌残留率整体呈下降趋势，尤其重要的是当磁场强度为某些特定值时，残留率表现出低于其两侧磁场强度下残留率的变化规律，并且残留率的波动呈现一种规律性，即谷值呈现出递推关系，这一现象符合电磁波生物学窗效应的特征，该效应是指生物体只有受特定频率参数与特定强度参数恰当组合的电磁波作用时才能产生最佳作用效果的一种生物学现象[10]。脉冲磁场杀菌的生物学窗效应在本课题组的研究中多次出现过[1-5]。在本研究中，相同磁场强度下，脉冲数为20时，杀菌效果最好；当脉冲数为20时，1、2.5T和3.5T是3个强度的窗值IW。
IW符合如下递推关系：IW(n)=n(9－n)/4－1
式中：n为“强度窗”的出现序次，n=1、2和3。其中，当n=3时，即磁场强度为3.5T，杀菌效果最好。
脉冲磁场杀菌的强度窗效应发生的机理尚在探索之中。
2.1.3 脉冲数对杀菌效果的影响
在磁场强度分别为1.0、2.5、3.5T，样品温度30℃、pH7.0的条件下，脉冲数变化对金黄色葡萄球菌杀菌效果的影响如图3所示。随着脉冲数的增大，不同磁场强度下的金黄色葡萄球菌残留率均呈现降低趋势，随着脉冲数的进一步增加，活菌残留率趋于稳定。出现这种现象的原因可能是细胞膜在瞬时脉冲周期性反复作用下，使离子容易穿过细胞膜，导致细胞膨胀，细胞膜变薄，而引起微孔迅速变大[11-12]。当脉冲数持续增加，一旦超过细胞膜所能承受的临界压力时，可造成胞内物质外喷，将导致细胞膜发生不可修复的破裂，即出现电穿孔[13]。虽然脉冲数的窗效应不像强度窗效应那幺明显，但从图3还可以看出，脉冲数的窗值是20。脉冲磁场杀菌中脉冲数的窗效应在本课题组以往的研究中也出现过[1-5]，但其发生机理也有待探讨。
图3 脉冲数对脉冲磁场杀菌效果的影响Fig.3 Effect of pulse number onStaphylococcus aureusinactivation
2.1.4 样品温度对杀菌效果的协同作用
图4 温度对脉冲磁场杀菌效果的影响Fig.4 Effect of environmental temperature onStaphylococcus aureusinactivation
在磁场强度3.5T、脉冲数20、pH7.0的条件下，样品温度对杀菌效果的影响如图4所示。随着温度的升高，金黄色葡萄球菌残留率逐渐降低，在30℃以后杀菌效果较好且趋于平缓，而在5～20℃范围内杀菌效果的改善非常显着，但此温度远低于金黄色葡萄球菌的热致死温度，说明温度对脉冲磁场的杀菌效果有协同作用。金黄色葡萄球菌的最适生长温度为37℃[15]，一般来讲，当介质温度处于最适生长温度范围内时，微生物对脉冲磁场的杀菌处理比较敏感，容易被杀死，而在较低温度下，杀菌效果不好，可能是由于微生物对不利其生存的环境表现出的抗逆性。
2.2 金黄色葡萄球菌脉冲磁场杀菌动力学的研究
由图3可知，在PMF作用下金黄色葡萄球菌的残留率变化与代表着杀菌总时间的脉冲数之间并非线性关系，因此在PMF作用下活菌残留率曲线不符合一级动力学模型。这与其他学者研究脉冲电场杀菌结果相一致[9,14]。为了研究PMF作用下金黄色葡萄球菌失活的动力学特性，用Gelow模型、Weibull模型和Hulsheger模型拟合图3中金黄色葡萄球菌残留率曲线数据的动力学参数值。拟合结果见表1。
表1 Gelow模型、Weibull模型和Hulsheger模型拟合的动力学参数Table 1 Parameters of Gelow, Weibull and Hulsheger models for percentage of residue viable cells
表1显示，不同磁场强度下3个模型中，3个磁场强度下Gelow模型拟合金黄色葡萄球菌残留率的相关系数R2均为最高，说明Gelow模型很好的拟合了PMF金黄色葡萄球菌残留率曲线。
3 结 论
3.1 磁场强度、脉冲数、温度等对脉冲磁场杀菌效果均有一定影响。随着磁场强度的增大，金黄色葡萄球菌ATCC25923残留率总体呈下降趋势，其中3.5T时杀菌效果最好。活菌残留率随脉冲数的增加也呈现降低趋势，在20个脉冲时达到最低，之后残留率趋于稳定。温度对脉冲磁场杀菌具有协同促进作用。
3.2 在磁场强度3.5T、脉冲数20个、样品温度30℃的条件下，脉冲磁场对金黄色葡萄球菌具有明显的杀菌效果，残留率可达7.29%。
3.3 金黄色葡萄球菌的脉冲磁场杀菌在本实验中表现出生物学窗效应，脉冲数的窗值为20；当脉冲数为20时，磁场强度的窗值IW符合如下递推关系：IW(n)=n(9－n)/4－1(n为“强度窗”的出现序次，n=1、2和3)。
3.4 Gelow模型、Weibull模型和Hulsheger模型中，Gelow模型能够较好地拟合脉冲磁场杀菌对金黄色葡萄球菌残留率的动力学曲线。
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Sterilization and Biological Window Effects of Pulsed Magnetic Field onStaphylococcus aureusand Its Inactivation Dynamics
XU Shen-shi1，MA Hai-le1,2,*
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. Jiangsu Provincial Research Center of Agricultural Products Bio-processing and Separation Engineering, Zhenjiang 212013, China)
TS205.9
A
1002-6630(2010)21-0020-04
2010-03-21
国家“863”计划重点项目(2007AA100405)
许审时(1985—)，男，硕士，主要从事强磁场设备与强磁场技术研究。E-mail：xushenshi@163.com
*通信作者：马海乐(1963—)，男，教授，博士，主要从事食品功能因子及其分离技术研究。E-mail：mhl@ujs.edu.cn
