海蓬子提取物抑制酪氨酸合成酶活性的研究

余晓红，申玉香，陈洪兴，邵荣*，许伟

海蓬子提取物抑制酪氨酸合成酶活性的研究

余晓红，申玉香，陈洪兴，邵荣*，许伟

(盐城工学院化学与生物工程学院，江苏盐城 224003)

研究海蓬子水提物、醇提物、超声波水提物、超声波醇提物，分别经蒸馏浓缩和旋转蒸发仪蒸发浓缩所得浓缩物对酪氨酸酶活性的抑制作用。结果表明，蒸馏浓缩和旋转蒸发仪蒸发浓缩对提取物的抑制率几乎没有影响。这4种提取物对以酪氨酸为底物的酪氨酸酶抑制作用存在显着性差异。抑制率分别为：水提物32.48%，醇提物62.37%，超声波水提物43.56%，超声波醇提物75.81%。其中海蓬子超声波醇提物表现出最好的抑制作用。

海蓬子；提取物；酪氨酸酶；抑制作用`

酪氨酸合成酶抑制剂在医药领域用于治疗和预防黑色素瘤、黄褐斑等色素沉着性疾病，在化妆品领域用于人体肌肤的美白[1]，在食品工业领域用于预防果蔬因褐变而失鲜变质[2]，在农业领域因酪氨酸合成酶是昆虫赖以生存的关键酶而成为最有前景的生物杀虫药剂之一[3]，因而酪氨酸合成酶抑制剂的开发有着广阔的应用前景。

海蓬子为黎科茎肉质化真盐生植物，利用海水灌溉，基本无需喷洒农药，种植管理简单、不生病虫害。海蓬子营养价值极高，是上佳的无公害绿色保健食品。除作为蔬菜之外还具有药用、保健价值，还可作为制造建材[4]。现代研究证明海蓬子中含有黄酮类物质[5]，黄酮类化合物具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗衰老、减少自由基的产生和清除自由基的作用。这与抑制酪氨酸合成酶活性有一定的联系。

实验分别制备了海蓬子水提物、醇提物、超声波水提物、超声波醇提物，各提取物分别经蒸馏浓缩和旋转蒸发仪蒸发浓缩得到浓缩物，进一步研究其浓缩物对酪氨酸合成酶合成活性的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土豆市售；海蓬子购于盐城绿苑海蓬子开发有限公司，为2009年夏季采收品。

酪氨酸郑州兴人化工产品有限公司；95%乙醇上海中试化工总公司；磷酸二氢钠宜兴市第二化学试剂厂；磷酸氢二钠鑫科股份合肥大学化学试剂厂；邻苯二酚天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

XD-SM50超声波微波组合反应系统南京光欧生物科技有限公司；RE52CS旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；TDC-40B台式离心机上海安亭科技仪器厂；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵巩义市予华仪器有限公司；HHS电热恒温水浴锅上海博讯实业有限公司医疗设备厂；XA-1固体样品粉碎机江苏金坛亿通电子有限公司；7202B可见分光光度计深圳市君达仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 各种提取物的制备

海蓬子水(醇)提物的制备：取冷冻干燥研磨过60目筛后的海蓬子粉末3g，加入60mL蒸馏水(或60mL体积分数为60%乙醇)浸泡24h，50℃回流提取1h。

海蓬子超声波水(醇)提物的制备：取研磨好的海蓬子粉末3g加入60mL蒸馏水(或60mL体积分数为60%乙醇)浸泡0.5h，煮沸30min，冷却至室温，用超声波(59kHz，500W，65℃)提取1h。

1.3.2 各种浓缩物的制备

蒸馏法浓缩：提取液60mL置于6000r/min离心4min，得上清液52mL，置于沸水锅里，直至试管内的液体挥发至5mL。

用旋转蒸发仪浓缩：提取液60mL置于旋转蒸发仪以60℃浓缩蒸发1h，混合液于6000r/min离心4min，得上清液5mL。

1.3.3 酪氨酸合成酶液的制备

在文献[6]的基础上稍加修改。将洗净的土豆置4℃冰箱预冷，去皮，切碎。在预冷的研钵中放入10g马铃薯，加入预冷的7.5mL pH7.2磷酸缓冲液，研磨匀浆。用两层纱布滤出提取液，立即于3000r/min离心10min。取上清液用pH7.2的磷酸缓冲液定容至100mL。2h内用完。

1.3.4 酪氨酸合成酶的酶促反应时间曲线的绘制

在25℃，取pH6.8磷酸缓冲液3mL，加入0.05mol/L的邻苯二酚反应液2mL与酪氨酸合成酶0.1mL混合，取3mL混合液立即于412nm波长处测定吸光度(A412nm)，连续记录3min，得A412nm-时间曲线。以pH6.8磷酸缓冲液作空白对照。

1.3.5 不同浓缩方法对酪氨酸合成酶活性抑制率的影响及其测定

取上述海蓬子提取液2mL，加pH6.8的磷酸盐缓冲液1mL与2mmol/L的酪氨酸溶液2mL，待混合均匀后在冰浴中迅速加入酪氨酸合成酶溶液1mL，混匀，37℃温育10min，于412nm波长处测定吸光度。酪氨酸合成酶抑制率计算公式为：

式中：A0为未加提取物样品的加酶混合液所测的吸光度；A1为未加提取物样品亦未加酶的混合液所测的吸光度；A2为加提取物样品和酶的混合液所测的吸光度；A3为加提取物样品而未加酶的混合液所测的吸光度。

1.3.64 种提取物的抑制效果比较

通过绘制海蓬子水提物、醇提物、超声波水提物、超声波醇提物对酪氨酸合成酶的酶促反应曲线，检测分别添加了4种相应海蓬子提取物前后的酪氨酸酶活性大小，并计算抑制率大小，从而比较四者的抑制效果。

2 结果与分析

2.1 酪氨酸合成酶的酶促反应时间曲线

图1 酪氨酸合成酶的酶促反应时间曲线Fig.1 Time course of tyrosinase-catalyzed enzymatic reaction

在酪氨酸合成酶的最适温度为25℃，最大吸收波长为412nm的条件下，以邻苯二酚为底物的酪氨酸合成酶反应时间曲线如图1所示。直线式陡峭上升部分为0～20s，为初速度阶段，逆反应较少；随后上升趋缓，逆反应速度渐大，达到反应平衡。

2.2 不同浓缩条件对酪氨酸合成酶活性抑制率的影响

图2 两种浓缩方法所得抑制率的比较Fig.2 Comparison on enzyme inhibition rates of extracts obtained from two condensation methods

由图2可知，蒸发浓缩和旋转蒸发仪浓缩这两种不同浓缩条件对酪氨酸合成酶活性的抑制率影响不大，说明海蓬子提取物中抑制酪氨酸合成酶活性的成分受温度的影响不显着。因此，下列实验均采用旋转蒸发仪对提取物进行浓缩。

2.3 乙醇的配伍作用对海蓬子醇提物的影响

由图3可知，用水回流浓缩后的海蓬子醇提物对酪氨酸合成酶有明显抑制效果，与未加提取物相比，酶

促反应时间曲线下移；至于海蓬子醇提物的酶促反应时间曲线继续下移，说明由于乙醇的配伍作用[7]，海蓬子醇提物对酪氨酸合成酶的抑制效果更加显着。总之，两种方式处理的海蓬子醇提物对酪氨酸合成酶都有明显的抑制效果。

图3 海蓬子醇提物的酶促反应时间曲线Fig.3 Time courses of tyrosinase-catalyzed enzymatic reaction with and without the presence of ethanol extract

2.44 种海蓬子提取物对酪酸合成酶活性的抑制效果比较

图4 海蓬子4种提取物的抑制效果比较Fig.4 Time courses of tyrosinase-catalyzed enzymatic reaction with the separate presence of four extracts

由图4所示，由于乙醇的配伍作用，海蓬子醇提物比水提物对酪氨酸合成酶的抑制效果更显着；因为超声波破碎细胞的空化作用和强化传质的机械作用，从而更有利于海蓬子活性物的释出，表现为超声波的醇提物比超声波的水提物具有更强的抑制作用。对酪氨酸合成酶的抑制率分别为：水提物32.48%，醇提物62.37%，超声波水提物43.56%，超声波醇提物75.81%。故最适宜选取超声波醇提方案提取海蓬子中酪氨酸合成酶抑制剂。

3 结论与讨论

海蓬子提取物对酪氨酸合成酶有明显的抑制作用，其对酪氨酸合成酶活性的抑制效果为：超声波醇提物＞醇提物＞超声波水提物＞水提物，抑制率分别为：超声波醇提物75.81%，醇提物62.37%，超声波水提物43.56%，水提物32.48%。蒸发浓缩和旋转蒸发仪浓缩这两种不同浓缩方法对酪氨酸合成酶的抑制效果差别不是很明显。

研究和开发生长于广袤海岸荒漠和海滩上的盐生植物，已成为当今世界农业的重大课题，在盐碱地上耕作是一种新的思维方式[8]。因为海蓬子生长在不毛之地的盐碱地上，土地费用比较低。另外，海蓬子无虫害，不需要用农药，也不需要锄草，种植管理费用不高[9-10]。海蓬子第一次成为酪氨酸酶抑制剂，它应该作为一个新的有希望的重要漂白剂材料考虑。海蓬子提取物可以作为天然美白活性物质应用于美白护肤品和功能食品，也可以作为预防和治疗黑色素瘤等色斑疾病的药物进行开发。

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Inhibitory Effect of Extract from Salicornia herbacea on Tyrosinase Activity

YU Xiao-hong，SHEN Yu-xiang，CHEN Hong-xing，SHAO Rong*，XU Wei
(College of Chemistry and Biological Engineering, Yancheng Institute of Technology, Yancheng 224003, China)

In this paper, the inhibitory effect of extract from Salicornia herbacea on tyrosinase activity was investigated. Four extracts including water extract, ethanol extract, ultrasound-assisted water extract and ultrasound-assisted ethanol extract were used as the materials to explore the inhibitory effect on tyrosinase activity. The results indicated that the extraction rate did not exhibit an obvious difference after distillation evaporation and rotary evaporation. However, the inhibition effect on tyrosinase had a significant difference among four extracts using tyrosine as the substrate. The inhibition rates on tyrosinase were 32.48% for water extract, 62.37% for ethanol extract, 43.56% for ultrasound-assisted water extract and 75.81% for ultrasound-assisted ethanol extract, respectively. Moreover, the ultrasound-assisted ethanol extract was the strongest enzyme inhibitor among them.

Salicornia herbacea；extracts；tyrosinase；inhibition effect

TS202.3

1002-6630(2010)21-0131-03

2010-06-27

盐城工学院“应用化学重点建设学科开放项目经费”资助项目(XKY2009004)；盐城市工业科技支撑计划项目(Yk2009047)

余晓红(1976—)，女，讲师，博士研究生，研究方向为微生物发酵和食品工艺。E-mail：yxh1127@163.com

*通信作者：邵荣(1973—)，男，教授，博士，研究方向为生物化工。E-mail：sr@ycit.edu.cn