周国燕，桑迎迎，宫春波，曹斌宏，王爱民
(1.上海理工大学低温医学与食品冷冻研究所，上海 200093；2.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109)
板栗壳色素的提取工艺优化及其抑菌性能
周国燕1，桑迎迎1，宫春波2，曹斌宏1，王爱民1
(1.上海理工大学低温医学与食品冷冻研究所，上海 200093；2.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109)
用乙醇法和超声波法从板栗壳中提取色素，并对两种方法进行比较，同时研究板栗壳中色素的抑菌性及其应用。正交试验结果显示：超声波具有省时、节能、提取率高等优点；超声波协助提取法的较优工艺参数为乙醇体积分数40%、超声波功率200W、作用时间8min。板栗壳色素对枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、黑曲霉和青霉具有抑制作用对苹果汁有一定的防腐效果。
板栗壳；色素；超声波；提取；抑菌性
Abstract：Brown pigment was extracted from chestnut shell by both alcohol-method and ultrasound-method. Both methods were analyzed and compared. The antibacterial effect and application of pigment from chestnut shell were also investigated.Results indicated that the ultrasound-method could save time and energy to obtain high extraction efficiency. The optimal conditions for ultrasonic extraction were ethanol concentration of 40% ultrasonic power of 200 W, and extraction time of 8 min.The pigment from chestnut shell had antibacterial effect againstBacillus subtilis,Escherichia coli,ActinomyceteandAspergillus niger. Therefore, the pigment has preservative effect on juice and can be developed to be a natural food preservative.
Key words：chestnut shell；pigment；ultrasonic；extraction；antibacterial effect
板栗(Castanea mollissimaBlume)属山毛榉科(Fagaceae)植物，为落叶乔木。我国种植板栗已有3000多年的历史，近年来我国板栗的栽培面积和产量迅猛增加，产量居世界第一。板栗果肉的开发利用一直受到广泛关注，但板栗壳作为加工废弃物基本上未得到有效开发与利用。板栗壳中含有一定量的色素物质，板栗壳色素属于黄酮类色素[1-2]，是一种水溶性好、着色力强、性质稳定的天然棕色素，且具有一定的抗氧化和抑菌作用，同时具有较高的热稳定性，是目前世界上并不多见的性质稳定的天然食用色素之一[3-7]，具有很高的开发价值。
天然色素存在于植物组织细胞内，细胞壁和细胞膜的破碎程度直接影响着提取效率。目前板栗壳色素的提取主要有水溶液提取、碱提取法、乙醇提取、超声波提取及微波提取法。研究发现前3种方法提取率较低、耗时，不利于提高生产效益。超声波提取技术是利用超声波的空化作用，提高细胞壁和细胞膜的通透性[8]，加速细胞内色素的溶出。张亚平[9]研究用2.0% NaOH溶液提取板栗壳色素，李红等[10]用水溶液提取色素3h，吴雪辉等[11]用乙醇提取3h，提取率能达到50%，但随着时间的增加，溶液蒸发得快，乙醇损失较多。超声波法提取提取率高、时间短，但能耗高。应用超声波法提取的研究目前还比较少。李云雁等[2]研究的超声波法协助提取板栗壳色素，是在超声波场中进行两次浸提，每次浸提时间较长。因介质吸收超声波后将其转化成热能，导致物料内部温度升高，长时间的超声作用使浸提温度明显上升，影响实验结果。本研究通过先进行超声提取再进行乙醇水浴浸提，大幅缩短超声提取时间，减少温度对实验的影响，希望能在醇提的基础上改进提取工艺、缩短时间、降低成本。
吴雪辉[12]、李云雁[13]等对板栗壳色素的抑菌性分别进行了研究，但对不同菌种的抑制作用差别较大，也没有进行实际应用的防腐实验，故本实验针对影响食品加工、贮藏的几种常见菌种重新考察抑菌性，并将板栗壳色素粗提物应用到新鲜苹果汁中考察实际抑菌效果，系统探讨该色素的抑菌性能。为板栗壳色素的开发利用提供依据，有助于其作为天然有效的食品防腐剂在工业中应用推广。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
板栗壳(市售板栗剥壳而得，粉碎至50目)；苹果市购；无水乙醇(AR)、可溶性淀粉、KNO3、MgSO4、FeSO4·7H2O 天津市博迪化工有限公司；PDA培养基、营养琼脂培养基、磷酸氢二钾(AR) 天津市巴斯夫化工有限公司；琼脂(BR) 石狮市琼脂粉加工厂；氯化钠(AR) 济南试剂厂。
1.2 仪器与设备
天孚牌JYT-S架盘药物天平 常熟市金羊砝码仪器有限公司；AP250D电子分析天平 奥豪斯国际贸易(上海)有限公司；LFJ粉碎机 嵊州市新颖粉碎设备有限公司；SPX型智能生化培养箱 宁波东南仪器有限公司；DHP-9082培养箱 龙口市先科仪器公司；UV-2100分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司；TGL-16C高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；UH-1200B超声波细胞粉碎仪 天津奥特赛思斯仪器有限公司；DZX-6050B干燥箱 上海福玛实验设备有限公司；HW.SY21-K6电热恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司；RE52-98真空旋转蒸发器、LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器 上海华线医用核子仪器公司；SQ380-C榨汁机 上海帅佳电子科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 色素的提取
1.3.1.1 乙醇法提取板栗壳色素
工艺流程：板栗壳→去杂→干燥→粉碎→乙醇溶液浸提→离心分离→滤液→真空减压浓缩→干燥→产品。
将干燥的新鲜板栗壳放入粉碎机中，粉碎(50目)，取适量粉料投入锥形瓶中，加入适量提取剂(乙醇溶液)，摇匀，水浴加热浸提。再用离心机分离(4000r/min，15min)，将所得滤液在旋转蒸发器中浓缩(45℃，真空0.09MPa)，浓缩至溶液呈黏稠状，浓缩液在干燥箱中干燥(60℃)至质量恒定。
影响板栗壳色素提取率的因素很多，板栗壳色素易溶于极性较大的溶剂而不溶或难溶于非极性溶剂[14]，试验选取乙醇为萃取剂。通过系列单因素试验和参考相关文献[15]，选取提取乙醇溶液体积分数、料液比、水浴温度、浸提时间4个因素，选用L9(34)正交试验表[16]，提取样液稀释25倍后在277nm波长处测定吸光度，以其吸光度为指标进行正交试验，以确定较优工艺参数。正交试验因素水平见表1。λmax=277nm作为板栗壳色素吸光度的特征波长[1]。
表1 乙醇法正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for alcohol extraction method
据刘平等[1]绘制出板栗壳色素质量浓度C与吸光度A的标准曲线，板栗壳色素在0.012～0.2mg/mL范围内，吸光度与质量浓度呈良好的线性关系，其回归方程为C=0.0695A－0.0001，R2=0.9999。式中：A为吸光度；C为板栗壳色素的质量浓度/(mg/mL)。色素提取率计算式：提取率/%=[CV/(1000m)]×100。式中：V为提取液体积/mL，m为板栗壳粉末用量/g。
1.3.1.2 超声波法协助提取法
工艺流程：板栗壳→去杂→干燥→粉碎→以乙醇溶液为溶剂，在超声波场中浸提→水浴浸提→离心分离(4000r/min，15min)→滤液→真空减压浓缩→干燥→产品。
向装有板栗壳粉末的小烧杯中加入适量的乙醇溶液，进行搅拌，将烧杯的口部用塑料薄膜封住以防乙醇挥发。将超声波探头插进料液内，探头不能碰到烧杯壁及底部。在超声波场中作用后，再进行水浴浸提。
试验选取提取乙醇体积分数、超声波功率和作用时间3个因素，在277nm波长处测定吸光度，以吸光度为指标进行L9(33)正交试验，确定超声波协助提取的最佳工艺。正交试验因素水平见表2。
表2 超声波法正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for ultrasonic extraction method
1.3.2 板栗壳提取物的抑菌作用
1.3.2.1 抑菌谱
以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、青霉、黑曲霉、放线菌为指示菌。细菌菌悬液、霉菌菌悬液的制备：将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种到营养琼脂培养基[17]斜面上，黑曲霉、青霉接种到PDA培养基[18]斜面上，放线菌接种到高氏一号培养基[19]斜面上。细菌于37℃培养2d，霉菌于28℃培养3d。取活化好的菌种斜面，用无菌生理盐水配制成(1～10)×106CFU/mL的菌悬液[20]，备用。
滤纸片法测定抑菌作用[21]：用无菌镊子将灭菌的直径为11mm的圆形滤纸片分别浸入无菌水、板栗壳提取液、40%的乙醇和5%苯酚溶液中，备用。用灭菌的移液管移取已制备好的菌悬液0.5mL，滴入已经倒有相应固体培养基的平皿表面，用涂布器使其均匀分布在培养基的表面。用无菌镊子夹取浸有以上4种液体的滤纸片，放入含菌平皿中，每皿3片。霉菌和放线菌用点种法接种，然后在靠近接种点的周围放上滤纸片，每皿3片。以上均在无菌工作台中操作。在相应的温度下培养一定时间，观察抑菌圈的大小，量取抑菌圈直径，取平均值。
1.3.2.2 板栗壳色素抑菌作用的应用
取4个新鲜的苹果，去皮，榨汁，分装在4个三角瓶中，每瓶50mL。板栗壳色素在较低质量浓度下有明显的抑菌作用[13]。向三角瓶中分别加入质量浓度为3、2、1、0.5g/100mL的板栗壳色素提取液10mL，对照试验组用40%的乙醇溶液。用灭好菌的移液管分别吸取0.5mL上述溶液和菌悬液于平板上，用涂布器使其均匀分布在培养基的表面。在相应的温度下培养一定时间，观察抑菌作用，以细菌总数为指标计数。
2 结果与分析
2.1 乙醇法提取板栗壳色素正交试验
表3 L9(34)正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experiments for alcohol extraction method
表4 正交试验方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments for alcohol extraction method
研究报道板栗壳色素为黄酮类色素[21]，易溶于乙醇溶液。从表3可以看出，乙醇体积分数、料液比、水浴温度、浸提时间均对板栗壳色素提取率有一定影响。极差分析结果表明，影响板栗壳棕色素提取的主要因素是提取温度，次要因素是料液比，再次因素是浸提时间，影响最小的是乙醇体积分数，其最佳组合是A2B1C3D3。因此，从板栗壳中提取棕色素的最佳工艺条件是：乙醇体积分数40%、料液比1:8(g/mL)、水浴温度80℃、浸提时间80min。随提取温度、提取时间、乙醇体积分数的增大，色素的提取率不断提高。经方差分析(表4)，水浴温度对板栗壳色素提取率的影响最大，且具有显着性差异。随提取温度的上升，色素提取率提高趋势增大。
2.2 超声波协助提取法正交试验
表5 L9(33)正交试验结果Table 5 Results of orthogonal experiments for ultrasonic extraction method
由表5可见，乙醇溶液的体积分数、超声波作用时间和超声波功率对板栗壳色素提取率有一定影响，影响依次为乙醇体积分数>超声波作用时间>超声波功率。在α=0.05下的方差分析显示以上3个因素对色素提取率影响的显着性不明显。提取率最高试验是第4组，即A2B1C2，因此最佳的提取工艺参数为乙醇体积分数40%、超声波功率200W、作用时间8min。在此工艺参数下提取率较高，为5.94%，且能耗小，提取时间缩短。
2.3 乙醇法与超声波协助提取法的比较
超声波协助提取是利用超声波的空化作用，使液体微粒之间发生猛烈撞击，提高细胞壁和细胞膜的通透性，加速细胞内色素的溶出，提高提取效率。在相同的试验条件下，超声波200W协助提取8min比仅用乙醇法浸提色素的提取率高了23%，可在较短的时间内从板栗壳中萃取出较多的色素成分，超声时间较短，料液温度变化小，减少浸提时温度上升对浸提率的影响，实验结果较准确。
从能耗、时间以及提取剂消耗的经济角度来看，超声波具有省时、节能、提取率高等优点，因此超声波的协助提取作用较显着。
2.4 色素的抑菌作用
2.4.1 抑菌谱
滤纸片实验结果：40%的乙醇溶液对6种指示菌无抑制作用。板栗壳色素提取液对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉、青霉有抑制作用，其中对枯草芽孢的抑制作用最为显着，抑菌顺序为枯草芽孢杆菌＞青霉＞大肠杆菌＞黑曲霉。对金黄色葡萄球菌和放线菌无抑制作用。5%苯酚溶液使微生物细胞内蛋白质变性从而达到抑菌作用。色素提取液对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、青霉的抑制作用强于5%的苯酚溶液。指示菌的抑菌圈直径见表6。
表6 指示菌抑菌圈实验结果比较Table 6 Comparison on antibacterial effects on experimental bacteria
2.4.2 板栗壳色素抑菌作用的应用实验结果
板栗壳提取物中含有黄酮类物质，这些物质的分子中一般都含有邻位酚羟基，具有与金属离子络合以及与蛋白质的强结合能力，极大地影响到微生物对营养物质的吸收和细胞代谢的活动，因此具有抑菌性能[22]。提取液应用于苹果汁中，由表7可见，随着提取物溶液质量浓度的增加，其抑菌作用越明显。可见板栗壳提取物在较低质量浓度下就有较明显的抑菌作用，在3g/100mL的质量浓度下可基本达到抑菌，是一种较有效的天然抑菌剂。
表7 不同质量浓度下的细菌总数Table 7 Total bacterial counts at different concentration conditions
3 结 论
乙醇法和超声波法都可从板栗壳中提取棕色素，但是超声波法比乙醇法具有更大的优势，省时、节能、提取率更高。板栗壳色素提取的最佳工艺条件为乙醇体积分数40%、料液比1:8(g/mL)、水浴温度80℃、浸提时间80min，超声波功率200W、作用时间8min。
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉是食品生产、加工和贮藏过程中常见的腐败菌种，板栗壳色素对其生长均有一定的抑制作用，其中对枯草芽孢杆菌的抑制作用最显着，且低浓度下抑菌明显，说明板栗壳色素具有良好的抑菌作用。板栗壳提取物中含有黄酮类物质，应用到苹果汁中，质量浓度3g/100mL的色素提取液可有99.86%的抑菌率，抑菌效果明显且无毒副作用，可作为天然的抑菌剂。
有研究表明，板栗壳色素有很好的热稳定性，经高温处理后，抑菌效果未发生明显的改变，且色素水溶液对光、热及氧化剂和还原剂的耐受力较强。我国板栗壳资源丰富，板栗壳色素不仅是天然色素，还有抑菌作用，无毒副作用，是值得大力推广使用的的天然色素和食品防腐剂。
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Optimal Extraction Parameters and Antibacterial Properties of Pigment from Chestnut Shell
ZHOU Guo-yan1，SANG Ying-ying1，GONG Chun-bo2，CAO Bin-hong1，WANG Ai-min1
(1. Institute of Cryo-medicine and Food Refrigeration, Shanghai University of Science and Technology, Shanghai 200093, China；2. College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)
TS202.3
A
1002-6630(2010)22-0101-05
2010-07-05
国家自然科学基金青年基金项目(50206013)；上海市重点学科建设项目(S30503)
周国燕(1970—)，女，副教授，博士，研究方向为食品冷冻冷藏和生物热系统。E-mail：efly_snow@163.com
