叶建芳，李文俊，赵文超，莫小晶，贾彩凤
(华东师范大学生命科学学院，上海 200241)
分光光度计法快速检测果汁中嗜热耐酸菌
叶建芳，李文俊，赵文超，莫小晶，贾彩凤*
(华东师范大学生命科学学院，上海 200241)
酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)是果汁污染的主要嗜酸耐热菌。它可以将香草酸或者香兰素转化为愈创木酚，后者在过氧化物酶的作用下产生红褐色产物，从而可以快速检测该菌。根据这个原理，设计实验探究该颜色反应的最优培养条件以及实际体系中检测该菌的可行性。结果表明：在静止培养情况下，在BAM培养基中添加100μg/kg的香草酸最有利于愈创木酚的产生；不同浓度的嗜热耐酸菌芽孢液在上述条件下培养，随着浓度的降低产生高浓度愈创木酚时间依次延迟，最低浓度为3个/mL的芽孢培养21h后，愈创木酚含量用分光光度计测定的光密度值OD470为1.0以上，为肉眼可见的红褐色；模拟实际体系下的培养也出现了颜色反应，证明该方法确实可以实现果汁中嗜热耐酸菌的快速、简便、高灵敏度的检测。
果汁；嗜热耐酸菌；愈创木酚；分光光度计；颜色反应
酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris，Aa)是果汁污染的主要嗜酸耐热菌[1]，国际贸易严格要求每10mL 浓缩果汁中该菌的含量不超过1个[2]。Aa超标是浓缩果汁生产中最为严重的质量问题之一，是近年来浓缩果汁生产厂家比较棘手的问题。该菌在常温下能代谢产生一种不愉快风味的化合物——2,6-二溴苯酚，在万亿分之一的浓度就会使果汁口感风味变差，甚至使其浊度升高乃至在包装物底部形成白色沉淀的危害[3]。
传统的Aa检测方法耗时很长，一般需要4～5d才能出检测报告[4]，检测结果的滞后性使之无法及时指导生产。用分子生物学的方法进行检测[5-6]，所需要的成本较高，对操作者的要求严格，且结果的重复性不佳，因此作为日常果汁检测，限制了其在小型果汁厂家的应用。生产中迫切需要一种快速、准确的Aa检测方法。
愈创木酚，化学名称为邻甲氧基苯酚，是一种略带清香的物质。愈创木酚在过氧化物酶的催化下可与过氧化氢反应，生成四愈创醌，该物质为红褐色。Aa能够代谢产生愈创木酚[7-9]，果汁中愈创木酚的存在可作为定性检测Aa的依据[9-12]。本研究通过优化培养基加快菌的生长，寻求最佳的产生愈创木酚的培养条件，并利用其颜色反应来检测Aa的存在。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
嗜热耐酸菌DSM2498 德国菌种保藏中心；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)德国Sigma公司；果汁：汇源100%不含防腐剂水果汁(A)、自制新鲜水果汁(B)；402、BAM、AAM、YSG、K氏5种[12]培养基；其他试剂均为国产分析纯。
GNP-9160 隔水式恒温培养箱、DK-S24 电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；DL-CJ-2ND超净工作台 北京市东联哈尔仪器制造有限公司；T6 新悦-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；YXQ-LS-75SII 高压蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TDL80-2B 台式离心机 上海安亭科学仪器厂；MDF-U32V 低温冰箱 日本三洋电气有限公司。
1.2 方法
1.2.1 芽孢的制备和计数
将菌种接种在402斜面上45℃培养1周，用5mL无菌水洗下芽孢，3500r/min离心10min，弃上清液。用无菌水复溶，重复4次，后用5mL无菌水复溶，4℃保存备用。计数采用平板计数法，将上述制备的菌液于80℃水浴锅中加热10min，稀释的菌液涂平板，45℃培养4d后计数。
1.2.2 颜色反应
[9]设计实验的反应体系为：1mL邻苯二甲酸氢钾缓冲体系＋0.3mL辣根过氧化物酶(HRP)＋50μL 3% H2O2＋2mL菌上清液。
1.2.3 最佳培养培养条件的选择
取上述芽孢原液0.1mL接入100mL AAM液体培养基中，在水浴锅中80℃加热10min，再加入1mL 100mg/mL香草酸[8]，45℃静止或100r/min振荡培养。每隔3h取样，测定菌液的比浊度OD420。将菌液5000r/min离心5min后取上清，测定OD470的光密度值用于计算愈创木酚的含量。
1.2.4 香草酸和香兰素对愈创木酚产生的影响
同1.2.3节方法，向 AAM培养基中加入香草酸或香兰素，45℃静止或100r/min振荡培养。不同时间取样测定菌液的比浊度OD420，并取上清测定愈创木酚的含量。
1.2.5 产生愈创木酚最优培养基的选择
同1.2.3节方法，把芽孢原液接入402、BAM、YSG、K氏、AAM5种培养基中，再加入香草酸或香兰素，45℃培养。每隔3h取样测定菌液的比浊度OD420。并取上清测定愈创木酚的含量。
1.2.6 不同浓度初始菌液培养结果
在BAM培养基中添加100μg/kg的香草酸，不同初始浓度的嗜热耐酸菌芽孢液(3×103、3×102、3× 101、3×100个/mL)在45℃恒温箱静止培养。每隔3h取样，测定菌液的比浊度OD420，并取上清液测定愈创木酚的含量。
1.2.7 果汁中嗜热耐酸菌培养及测定
培养体系：灭菌的BAM培养基(内含香草酸)，每份1.8mL装入7mL无菌EP管中。
待检样品制备：将嗜热耐酸菌菌液分别用A和B果汁梯度稀释，使芽孢的终浓度为103、102、101、100个/mL，同时用相应果汁做空白对照，在水浴锅中80℃加热10min；预培养：培养体系中加入制备的待检样品0.2mL，45℃静止培养24h；检测：培养液中加入50μL H2O2溶液，1mL邻苯二甲酸氢钾缓冲体系，0.3mL HRP，10min后观察显色，并用相机拍照。
2 结果与分析
图1 振荡与静止培养(AAM培养基)培养结果Fig.1 Effect of stationary culture and shaking culture on guaiacol production
2.1 转速对愈创木酚产生的影响如图1所示，在进行培养时，振荡培养明显快于静止培养时菌的生长速度，但是两种条件下产生愈创木酚含量相差不大，且静止培养较符合实际应用体系，所以以下采用该培养条件。
2.2 香草酸和香兰素对愈创木酚产生的影响
图2 添加香草酸(A)和香兰素(B)对BAM培养基培养结果Fig.2 Effect of vanillic addition acid vanillin addition on guaiacol production
图3 4种培养基对创愈木酚的影响Fig.3 Effect of different culture media on guaiacol production
如图2所示，添加香草酸的培养基比添加了香兰素的培养基产生的愈创木酚的量更多且速度更快，所以在以后的实验中采用香草酸为添加剂。
2.3 不同种类培养基对愈创木酚产生的影响
K氏培养液不利于酸土菌的生长，无法得到OD值；另4种培养基培养结果如图3所示：YSG培养基菌生长缓慢，且斜率较小；402培养基的静止期长；AAM培养液菌的静止期较短(9h)，但菌液的最高OD420值不高，仅为1.7左右；BAM培养基培养静止期短，愈创木酚产生的指数期提前，且在12h愈创木酚产生量最大达到OD4702.0，更适合做该菌检测的培养基。综合5种培养基的培养效果，选定BAM培养基为最优培养基。
2.4 不同浓度初始菌液培养结果
不同浓度的嗜热耐酸菌芽孢液(3×103、3×102、3×101、3×100个/mL)在上述条件下培养，随着浓度的降低产愈创木酚的时间依次延迟，最低浓度为3×100个/mL的芽孢液经培养21h后得到的培养液，愈创木酚的含量用分光光度计测定的光密度值OD470为1.0以上(图4)，为肉眼可见的红褐色。
图4 不同浓度初始菌液培养结果图Fig.4 Effect of initial cell suspension density on guaiacol production
2.5 模拟试剂盒的检测结果
以图5、6为试剂盒简单模型和部分实验结果(以苹果汁为例)，左侧颜色最浅的为空白对照，从左到右分别是3×103、3×102、3×101、3×100个/mL菌液的检测结果。可以看到，所有的待检样品检测都呈现肉眼可见的红褐色，证明该检测方案确实可行。
图5 待检市售100%不含防腐剂苹果汁样品检测结果Fig.5 Detection results of commercial 100% apple juice sample without preservatives
图6 待检自制新鲜苹果汁样品检测结果Fig.6 Detection results of home-made apple juice sample
3 讨 论
3.1 设计最佳颜色反应体系
按设计的颜色反应体系(1mL缓冲体系＋0.3mL HRP＋50μL 3% H2O2＋2mL愈创木酚溶液)进行实验，得到了最佳的反应pH值和反应时间，同时愈创木酚标准曲线的制作证明了愈创木酚含量与吸光度之间确实存在着正相关的相关关系，为以后研究吸光度与菌液浓度之间的关系提供依据。
3.2 培养条件的优化
以添加香草酸的BAM培养基并在静止条件下优化培养，在24h内，3×100个/mL的最小浓度嗜热耐酸菌的愈创木酚产量也达到了OD最大值，由此，与传统的平板培养法相比，上述研究结果显示，用颜色反应监测嗜热耐酸菌，把检测该菌的时间缩短到了24h之内，具有极大的可行性，能够很大程度的提高工厂的实际生产效益。
3.3 实际检测体系的应用
依据设计出的检测体系，经过实验验证，确实可以达到检测出样品中嗜热耐酸菌的目的，为以后的定量检测提供了参考，也证明了该方法在实际应用中的可行性。
参考文献：
[1]李静媛. 果汁中的嗜酸耐热菌[J]. 食品与发酵工业, 2002, 29(3)∶84-88.
[2]许占位, 余清谋, 刘永建. 浓缩果汁生产中嗜热耐酸菌的控制[J]. 饮料工业, 2003, 6(5)∶ 32-34.
[3]姚培新, 马小魁. 浓缩果汁生产厂中嗜热耐酸菌的跟踪检测[J]. 饮料工业, 2001, 4(3)∶ 42-45.
[4]MURRAY M B, GURTLER J B, RYU J H, et al. Evaluation of direct plating methods to enumerate Alicyclobacillus in beverages[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 115(1)∶ 59-69.
[5]常玉华. 果浓缩汁中耐热菌的PCR法快速检测研究[D]. 西安∶ 陕西师范大学, 2003.
[6]CONNORA C J, LUO Hongliang, MCSPADDEN G B B, et al. Development of a real-time PCR-based system targeting the 16SrRNA gene sequence for rapid detection of Alicyclobacillus spp. in juice products[J]. International Journal of Food Microbiology, 2005, 99(3)∶ 229-235.
[7]杨康, 岳田利, 袁亚宏, 等. 利用顶空SPME-GC-MS 联用技术检测苹果汁中嗜酸耐热菌代谢产物的研究[J]. 农产品加工∶ 学刊, 2007 (3)∶ 8-17.
[8]BAHCECI K S, GOKMEN V, ACAR J. Formation of guaiacol from vanillin by Alicyclobacillus acidoterrestris in apple juice∶ a model study[J]. Eur Food Res Technol, 2005, 220(2)∶ 196-199.
[9]BAHCECI K S, ACAR J. Determination of guaiacol produced by Alicyclobacillus acidoterrestris in apple juice by using HPLC and spectrophotometric methods, and mathematical modeling of guaiacol production[J]. Eur Food Res Technol, 2007, 225(5/6)∶ 873-878.
[10]AL-QADIRI H M, LIN Mengshi, CAVINATO A G. Fourier transform infrared spectroscopy, detection and identification of Escherichia coli O157∶H7 and Alicyclobacillus strains in apple juice[J]. International Journal of Food Microbiology, 2006, 111(1)∶ 73-80.
[11]周金燕, 张发群, 舒远才. 愈创木酚法测定锰过氧化物酶活力[J]. 纤维素科学与技术, 1993, 1(1)∶ 34-37.
[12]BEVILACQU A, SINIGAGLIA M, CORBO M R. Alicyclobacillus acidoterrestris∶ New methods for inhibiting spore germination[J] International Journal of Food Microbiology, 2008, 125(2)∶ 103-110.
A Rapid Spectrometric Method for Detecting Alicyclobacillus acidoterrestris in Fruit Juice
YE Jian-fang，LI Wen-jun，ZHAO Wen-chao，MO Xiao-jing，JIA Cai-feng*
(School of Life Science, East China Normal University, Shanghai 200241, China)
In the presence of Alicyclobacillus acidoterrestris, vanillic acid and vanillin can be converted into guaiacol, which can be further converted into a reddish-brown product by peroxidase. Based on this color reaction, a method was developed to spectrometrically detect the presence of Alicyclobacillus acidoterrestris in real systems. In static culture, BAM medium with the addition of 100μg/kg vanillic acid was the most favorable for guaiacol formation. The peak value of guaiacol concentration was delayed along with the decrease of bacteria concentration. A visible color was formed in medium and its OD470 could reach up to 1.0 or even more after 21 hours of culture at the initial spore density of 3 spores/mL. And the same result also was obtained in an apple juice system. Thus, this method can allow rapid, simple and sensitive detection of Alicyclobacillus acidoterrestris in fruit juice.
juice；Alicyclobacillus acidoterrestris；guaiacol；spectrophotometer；color reaction
Q935
A
1002-6630(2011)14-0241-04
2010-11-02
上海市大学生创新活动计划项目(KY2009-12S)
叶建芳(1990—)，女，本科生，研究方向为微生物学。E-mail：wzaybh@yahoo.com
*通信作者：贾彩凤(1979—)，女，工程师，博士研究生，研究方向为微生物学。E-mail：cfjia@bio.ecnu.edu.cn
