闫景坤，吴建勇，金 蓓，崔海英
(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.香港理工大学应用生物与化学科技系，香港；3.湛江师范学院化学科学与技术学院，广东 湛江 524048)
酸水解冬虫夏草胞外多糖的分子质量变化及动力学研究
闫景坤1，吴建勇2，金 蓓3，崔海英1
(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.香港理工大学应用生物与化学科技系，香港；3.湛江师范学院化学科学与技术学院，广东 湛江 524048)
以冬虫夏草胞外多糖为研究对象，通过凝胶渗透色谱分析酸水解多糖的分子质量、分子质量降解率(MWDR)和多分散指数(MW/Mn)的变化规律，并在此基础上探讨酸水解动力学。结果表明：酸水解可得到高分子质量和低分子质量两个多糖组分，高分子质量多糖组分的含量、分子质量和MW/Mn均随酸解时间的增加而减小，而MWDR呈线性增加趋势。低分子质量多糖组分含量随酸水解时间的增加而增加，分子质量基本维持在3.0kD；MWDR在0.5h内呈线性增加趋势，大于0.5h后基本维持在0.25。胞外多糖的酸水解模式为中心链断裂，符合假一级反应动力学方程，反应速率常数为3.24×10-2min-1，远小于随机链断裂的反应速率常数。
冬虫夏草；胞外多糖；酸水解；分子质量；动力学
多糖作为一类重要的生物大分子主要应用于食品、医药和化妆品等领域。然而，由于天然活性多糖的分子质量大、结构复杂、水溶性差，不利于生物吸收并发挥生物活性，极大地限制了多糖的应用和发展。通过控制降解往往可以改善多糖本身的性能功效，从而扩大产品的应用或降低产品的毒副作用。目前，多糖降解主要通过酶解、氧化降解、热处理、超声波降解以及酸水解等多种方式[1-2]。其中酸水解操作较简便，降解速度可控，是制备低聚物的有效方法，在实验研究中普遍采用[3-5]。
冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.) Sace.) 是我国珍稀的药用真菌，具有广泛的生理活性和药用价值，多糖为其中主要活性成分。天然冬虫夏草多糖分子质量大，溶解性差，难以直接应用，因而有必要通过降解优化其性质。笔者前期研究[6]发现，酸水解可以降低冬虫夏草胞外多糖的分子质量和黏度，且酸水解产物具有较好的清除自由基和体外抗氧化活性。然而，酸水解过程中分子质量、MW/Mn和MWDR的变化规律及酸水解动力学等方面的研究还未涉及。因此，本实验依据前期研究，对冬虫夏草胞外多糖酸降解产物的分子质量变化规律及动力学进行深入探讨和分析，旨在为冬虫夏草多糖的开发和应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
经乙醇沉淀、脱蛋白、脱色和透析等方法得到的冬虫夏草胞外多糖由香港理工大学深圳研究院吴建勇副教授课题组提供。
T-系列葡聚糖 美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
分析天平 日本Shimadzu公司；电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司；pH计 德国WTW实验室；冷冻干燥机 丹麦Heto-Holten A/S公司；凝胶渗透色谱仪(Breeze V3.3工作站，1525 Binary HPLC泵、717 plus 自动进样器、2414Refractive Index 检测器) 美国Waters公司；TSK-G3000凝胶渗透色谱柱(7.8mm×300mm，5μm) 日本Tosoh公司；脱气装置 昆山市超声仪器公司。
1.3 方法
1.3.1 多糖的酸水解
冬虫夏草胞外多糖的酸水解按照文献[2]的方法并稍作修改：胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)为经脱蛋白、脱色和透析处理的冬虫夏草胞外多糖，首先将其溶解在水中配成0.1g/100mL的溶液，80℃搅拌2h，室温放置过夜。对于多糖的酸水解，20mL已处理好的EPS溶液置于50mL具塞离心管中，通过添加一定体积的1mol/L H2SO4使其多糖溶液的pH值为1.0，封管。多糖的水解在90℃水浴中反应0.5～10h。水解结束后，酸性多糖溶液立即置于冰浴中冷却，1mol/L NaOH调节反应液的pH值至中性，冷冻干燥得酸水解产物，并依次命名为EPS-A、EPS-B、EPS-C和EPS-D。
1.3.2 凝胶渗透色谱(GPC)分析
胞外多糖及酸水解产物的分子质量及分子质量分布采用高效液相凝胶渗透色谱法(HPGPC)[7-8]。凝胶渗透色谱系统：色谱条件：TSK-G3000凝胶渗透色谱柱(7.8mm×300mm，5μm)；SWxl 凝胶色谱柱(4mm×6mm，7μm)与TSK-G5000柱串联；流动相：0.02mol/L磷酸二氢钾溶液；流速0.6mL/min；柱温35℃；进样量20μL。样品处理：准确称取4.0mg多糖样品用流动相溶液配制成质量浓度为2mg/mL，经过10000r/min高速离心10min后，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，立刻进样测定其分子质量和分子质量分布。已知分子质量的葡聚糖标准品系列：5.2～668kD。葡聚糖(GPC)校正曲线方程为lgMw＝10.614－0.386VE(VE为洗脱体积)，R2＝0.9701。在线Breeze V3.3分析软件用于分析GPC图，得到多糖样品的重均分子质量(Mw)、数均分子质量(Mn)和分子质量分布(MWD)。
1.3 多糖酸解产物的分子质量降解率(MWDR)的计算
式中：Mt和M0分别表示酸解时间为tmin和0min的分子质量。较大值的分子质量降解率表明酸解引起分子质量更大的减小或发生较大的分子降解。
2 结果与分析
2.1 酸水解多糖的分子质量变化
表1 EPS及酸水解产物的分子质量及分子质量分布Table 1 Molecular weight and molecular weight distribution of EPS and its hydrolysates as determined by GPC
表1为特定反应温度(90℃)和pH值、不同反应时间(0.5、1、5、10h)条件下冬虫夏草EPS及酸水解产物的Mw、Mn和MWD[6]。EPS经酸水解产生了两个峰，一个是高分子质量峰，Mw范围26～36kD；一个是低分子质量峰，分子质量维持在3.0kD左右。随酸解时间的延长，酸解产物的MWD总体上表现为高分子质量多糖的含量逐渐减少，而低分子质量多糖的含量逐渐增多。此外，从峰面积可以发现，低分子质量多糖的相对比例在酸解30min时从0%增加到18%；当酸解10h时，低分子质量多糖的相对比例高达92%。这表明酸水解产物分子质量＞30kD的多糖组分在酸水解过程中被降解成低分子质量的多糖分散在酸水解体系中且为具有特定分子质量(3.0kD)的小分子多糖组分。
2.2 分子质量降解率
图1 EPS在pH1.0、90℃时随酸水解时间变化的MWDRFig.1 Measured MWDR during acid hydrolysis of EPS at pH 1.0,90 ℃
EPS酸水解后较高分子质量组分(峰1)和较低分子质量组分(峰2)的MWRD随酸水解时间的变化如图1所示，随酸水解时间的延长，高分子质量组分的MWRD呈线性增加；另一方面，在酸处理0.5h时，较低分子质量组分的MWRD迅速增加，然后趋于平缓且维持在0.25左右。这表明酸水解EPS主要得到两种酸解产物(峰1和峰2)，且在酸水解0.5h内是最有效的。较低分子质量组分的MWDR在酸水解时间大于0.5h后趋于渐近线，在较长酸水解时间内有限的MWDR导致降解得到的较低分子质量多糖组分有较低的分子质量分布，这可能是由于MWDR随分子质量的减小而减小的缘故[9]。这与前人[10-11]所报道的实验结果相类似。此外，较高分子质量组分的MWDR随酸水解时间呈线性增加且R2＝0.98，表明酸水解主要获得特定分子质量大小(3.0kD)和较窄分子质量分布(MW/Mn约为1.0)的降解产物。
2.3 多分散指数(MW/Mn)的变化
EPS酸水解后较高分子质量组分(峰1)和较低分子质量组分(峰2)的MW/Mn随酸水解时间的变化如图2所示，较高分子质量组分(峰 1)的MW/Mn随着酸水解时间的增加而逐渐减小，MW/Mn在1～2范围内变化，且随酸水解时间的变化呈较好的线性关系(y＝－0.0431x＋1.4701，R2＝0.9799)。较低分子质量(峰2)的MW/Mn在酸水解0.5h后基本不随酸水解时间的变化而变化，近似为一渐近线且多分散指数值接近1.0，表明酸水解EPS，得到更窄、更一致的分子质量分布的低分子质量多糖组分。
图2 EPS在pH 1.0、90℃时随酸解时间变化的MW/MnFig.2 MW/Mn during acid hydrolysis of EPS at pH 1.0, 90 ℃
Casale等[12]指出多分散性依赖于反应机理，也就是说，多糖链断裂过程中特定与随机的断裂是相对的。多分散指数为2，表明反应为随机断裂；Mw/Mn为1～2表明接近中心链断裂。
综合表1、图1和图2能够发现：从冬虫夏草EPS酸水解得到的单一且具有特定分子质量的低分子质量酸解产物，可以揭示EPS的酸水解是特定的、非随机链断裂过程。此外，Mw/Mn的变化揭示链断裂机理[13]：中心链断裂通常使Mw/Mn减小，而随机链断裂不能改变多分散指数，这与Casale等[12]所报道的结论相一致。因此，根据实验结果及相关文献资料，中心链断裂被推测为EPS酸水解过程中链断裂的主要模式。
2.4 酸水解动力学研究
前期研究[14-15]表明：不同多糖的酸水解反应基本上是随机链断裂且遵循一级反应动力学方程：
式中：L为水解多糖键的总数量；k为反应速率常数；t为降解时间。水解多糖键的总数量在反应时间为t时可以表达为：
式中：Mt为多糖的平均分子质量；m为单糖的分子质量；Nt为多糖分子的数目。如果Mt/m远大于1，那幺多糖的Mw或Mn和水解时间可用下式来表示：
式中：k或k′为反应速率常数；t为反应时间/min；Mt和M0分别为反应时间为tmin和0 min时的分子质量；m为单体分子质量。
在pH1.0和90℃条件下酸水解得到较高分子质量多糖组分(峰1)的MW随时间变化的倒数关系如图3所示。较高分子质量多糖组分MW的倒数和酸水解时间在反应初期 (0～0.5h)呈一定的线性关系；但是，随酸水解时间的延长，线性关系变差且整个酸水解时间内相关系数(R2)仅为0.9295。因此，图3的实验结果与方程(4)存在一定偏差。
然而，Emsley等[13]指出高聚物在降解过程中不仅存在随机链断裂而且也存在中心链断裂。随机链断裂不能显着改变分子质量分布的位置或产生新的峰，随机链断裂过程中Mw的倒数和酸水解时间的关系呈线性关系，且遵循一级反应动力学方程；而中心链断裂可以改变峰的位置、产生新峰和加宽峰，中心链断裂往往导致Mw倒数和降解时间的关系产生曲率，可以用假一级反应动力学方程来表达1/Mw和酸水解时间的数学关系。
图3 在pH 1.0、90℃时高分子质量组分的MW随酸水时间的变化图Fig.3 Plot of 1/ MW of HMWF versus hydrolysis time at pH 1.0, 90 ℃
此外，从图1、2及表1的实验结果中也可以揭示，冬虫夏草EPS的酸水解为中心链断裂。因此，假一级反应动力学方程可以用来阐释EPS酸水解过程，即方程(4)可近似表达为：
通过方程(5)和图3得到相关数据：EPS在90℃、pH 1.0的条件下酸水解反应速率常数k为3.24×10-2min-1(或k′＝0.26mol/(g·min))，酸水解时间为0时多糖的重均分子质量MW(0)为38.0kD，这与Xu Chunlin等[2]所报道的酸解速率要小得多(k＝1.51min-1)，表明多糖在酸解过程中随机链断裂的反应速率要远大于中心链断裂的反应速率。
3 结 论
冬虫夏草EPS酸水解的分子质量随酸水解时间的延长，较高分子质量多糖组分含量和分子质量均逐渐减小，而较低分子质量多糖组分含量逐渐增加，且分子质量基本维持在3.0kD。
高分子质量多糖组分MWDR成线性增加趋势，而较低分子质量多糖组分MWDR在降解0.5h内迅速增加，当大于0.5h，MWDR不随酸水解时间变化而变化维持在0.25左右。
高分子质量组分的MW/Mn随着酸水解时间的增加而逐渐减小且呈较好的线性关系，且MW/Mn在1～2变化；低分子质量多糖组分的多分散指数在酸水解0.5h后基本保持不变。EPS的酸水解模式为中心链断裂，符合假一级反应动力学方程1/Mt≈1/M0＋kt/m，反应速率常数为k＝3.24×10-2min-1。
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Molecular Weight Changes and Kinetics of Acid Hydrolysis of Exopolysaccharides Isolated fromCordyceps sinensis
YAN Jing-kun1，WU Jian-yong2，JIN Bei3，CUI Hai-ying1
(1. School of Food and Biological Technology, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. Department of Applied and Biology and Chemical Technology, Hongkong Polytechnic University, Hongkong, China；3. School of Chemistry Science and Technology, Zhanjiang Normal University, Zhanjiang 524048, China)
In this study, exoplysaccharides were isolated fromCordyceps sinensis. Gel permeation chromatography (GPC) was used to determine molecular weight (MW) and molecular weight distribution of exopolysaccharides subjected to acid hydrolysis.The results showed that high molecular weight fraction (HMWF) and low molecular weight fraction (LMWF) of exopolysaccharides were obtained by acid hydrolysis. The content,MW and polydispersity index (PDI) of HMWF decreased with increasing reaction time, but the molecular weight degradation ratio (MWDR) showed a linear increase. On the other hand,the content of LMWF increased with increasing reaction time, with mostly a molecular weight of 3.0 kD. The MWDR of LMWF showed a linear increase within the first half an hour of reaction. Afterwards, the MWDR kept constant at about 0.25. Acid hydrolysis of exopolysaccharides was systemetic scission, which followed the pseudo first-order kinetics. The obtained value of rate constantkwas 3.24 × 10-2min-1, which was much less than that of random scission.
Cordyceps sinensis；exopolysaccharides；acid hydrolysis；molecular weight；kinetics
TS201.2
A
1002-6630(2012)11-0082-04
2011-06-10
江苏大学校基金资助项目(105DG129)；广东省高校优秀青年创新人才培育项目(LYM09100)
闫景坤(1980—)，男，讲师，博士，主要从事天然活性多糖的提取、分离纯化、结构表征及化学修饰研究。E-mail：jkyan_27@163.com
