李江涛，张久亮，何 慧*，聂志奎，马芝丽
(华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)
乙醇非氧化代谢产物脂肪酸乙酯的研究进展
李江涛，张久亮，何 慧*，聂志奎，马芝丽
(华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)
脂肪酸乙酯(fatty acid ethyl esters，FAEEs)是乙醇经非氧化代谢途径的产物，其在诱导器官损害方面发挥着重要的作用，可作为长期摄入酒精的标记物。本文对FAEEs在体内的毒性、作为酒精摄入标记物的证据、相关合成酶提取以及FAEEs的检测等方面的研究进展进行综述，以期为乙醇代谢研究方面提供一定的理论依据。
脂肪酸乙酯(FAEEs)；乙醇非氧化代谢；乙醇摄入标记物；细胞毒性
2011年以来，我国白酒消费人群大约有4亿，年实际消费量在500万t左右。过量摄入酒精对人体消化、神经、骨骼、造血等多种系统都有一定毒性。乙醇的代谢途径主要是氧化代谢，即在乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)、微粒体乙醇氧化系统和过氧化氢酶的作用下氧化为乙醛，乙醛进一步在乙醛脱氢酶的作用下氧化为乙酸。同时，乙醇还可通过非氧化方式与脂肪酸发生酯化反应，生成脂肪酸乙酯(fatty acid ethyl esters，FAEEs)，这个代谢过程是通过脂肪酸乙酯合成酶催化完成的[1]，当乙醇有氧代谢被抑制时，将会增加FAEEs的生成量，FAEEs的存在很可能导致胰腺炎、肝炎、心肌消融等疾病危害。
长期嗜酒对人体的伤害是很严重的，虽有研究[2]表明，酒精摄入量与肝损害的严重程度并不呈显着相关，但据有关调查发现，嗜酒人群中约有20%～30%会出现严重的肝损害[3]。另有相关器官验尸结果证明，人体器官的损伤很多时候是因为酒精滥用造成的[4]。在急性酒精中毒的案例中，FAEEs在人体胰腺中含量最高，此外，肝脏、心脏和大脑等器官中也有较低浓度的FAEEs存在；并且在胰腺中并未发现乙醇有氧代谢的产物——乙醛[5]。这表明，在酒精中毒案例中，人体内的FAEEs含量可作为一个关键的衡量指标。通过体内实验发现，在胰腺和肝脏中，通过抑制可在有氧条件下催化乙醇氧化为乙醛的酶(ADH、细胞色素P450和过氧化氢酶等)的活性即可抑制酒精的氧化代谢，从而使乙醇按生成FAEEs的非氧化代谢途径进行反应[6]。
1 脂肪酸乙酯的毒性
早在1963年，Goodman和Deykin就对脂肪酸乙酯进行了相关描述，认为它是乙醇的代谢产物，Goodman在1980年进一步提出它可能是过量饮用酒精导致器官损伤的媒介物；特别在乙醇氧化功能缺陷或者较弱的组织中，可以导致组织细胞膜结构和功能的异常、细胞膜氧化磷酸化的脱偶联及蛋白质的合成受抑制等[7]。到1986年，对急性酒精中毒致死的人进行解剖实验发现，酒精滥用和FAEEs的产生有重要联系。验尸结果表明，FAEEs的产生和器官损伤有很强的相关性，可作为酒精摄入的标记物[5]。酒精滥用致器官的损害大部分发生在胰腺、肝脏、心脏和大脑。据检测，这些器官中通常含有很高活性的脂肪酸乙酯合成酶和高浓度的FAEEs。近年来，有研究[8]表明乙醇摄入后产生FAEEs，然后传送到心脏，进而引起心肌消融。因此，心肌消融的机制可能涉及到FAEEs的细胞毒性作用。
目前，众多的体内和体外实验均证实FAEEs在体内和体外均显示出毒性作用。Zbigniew等[9]通过体外实验研究发现FAEEs融合于低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)中，能够发挥其完整的细胞毒性作用。利用600μmol/L的油酸乙酯或800μmol/L的花生四烯酸乙酯培养人肝癌HepG2细胞，其对细胞生长的抑制率分别达到31%和37%，LDL与400μmol/L的油酸乙酯培养HepG2细胞，会使其蛋白质合成率下降41%。同时，透射电镜观察结果显示，细胞形态也会发生了很大变化，尤其是细胞核内的染色质固缩。该研究还证实了FAEEs在LDL内能够降低HepG2细胞的复制及蛋白酶的合成速率[10]。人们在培养细胞时发现，FAEEs的合成在人肝癌HepG2和E47细胞(即转染并表达人CYP2E1的HepG2细胞)中比在人肺细胞VA13和VL-17A细胞(即过表达乙醇脱氢酶和CYP2E1的人肝癌HepG2细胞)中浓度增长幅度更高[11]。该研究表明，一方面，不管CYP2E1(细胞色素P4502E1)是否过表达，ADH催化乙醇氧化是其主要的机制；另一方面，不管CYP2E1是否过表达，在E47细胞中，发现乙醇无氧代谢产物FAEEs能够降低ADH的活性。因此，CYP2E1介导的乙醇氧化可能是次要的机制。Hikmet等[12]研究表明，FAEEs能够诱导HepG2细胞发生凋亡，并且干扰了细胞的G2/M期，使细胞的S期下降[13]。
Walter等[14]通过体内实验发现，在大鼠内，通过灌胃浓度为11μmol/L的FAEEs为核心的低密度脂蛋白，大鼠全身会发生水肿，细胞内脂质堆积，导致胰腺细胞膜受损，这可能是血清蛋白酶和胰腺酶原被激活的缘故。目前，虽已有不少专家、学者认同FAEEs在乙醇滥用中作为媒介物引起器官的损伤这一观点，但是其导致细胞毒性的机制尚待进一步研究。有研究[15]提出这可能是水解的FAEEs抑制了细胞核的转录，但尚无可靠的理论依据。
2 脂肪酸乙酯代谢相关酶及其代谢途径
目前，在体内催化FAEEs合成的酶有脂蛋白脂肪酶、羧酸酯酶、羧基酯脂肪酶等，FAEEs的催化合成，可能需要2种酶，即水解酶和酯合酶，并且水解酶是限速酶。细胞质中的酶，例如谷草转氨酶、脂肪酶、淀粉酶会在肝脏和胰腺受损后出现在血液中，可以假设FAEEs合成酶既与细胞质、细胞膜结合，同时也会在肝脏和胰腺损伤后释放到血液中[8,16]。
在1984年，从兔心肌介质中分离纯化出FAEEs酯合酶，在分离纯化前，通过DEAE-纤维层析柱分离得到2种活性峰，纯化后两者的含量在总提取物中的比例超过了40%，SDS-PAGE分析得到单一的多肽，其分子质量为26kD，采用凝胶渗透色谱分析表明，活性酶的分子质量为50kD, 这一结果表明，这种酶是由2个相同或接近相同的亚基组成的可溶性二聚体酶[17-18]。
1987年，研究发现人的大脑灰质合成酶活性大约是脑白质合成酶活性的2倍。通过离子交换色谱分离得知，这两种形式的合成酶存在于灰质和白质组织匀浆后的细胞质或松散结合的膜组分中[19]。这份报告同时表明，血液中乙醇浓度较高，在大脑皮层中FAEEs浓度亦较高，这表明，FAEEs在人类大脑中能致急性中毒。
1991年，有研究者测定了摄入乙醇的大鼠脂肪组织中的不同时期的FAEEs的浓度和FAEEs合酶活性，在乙醇灌胃10周后，每克脂肪组织检测到300nmol FAEEs，更重要的发现是，FAEEs从乙醇停用1周后完全消失[19]。在这项研究中发现大部分FAEEs存在于一个孤立的脂肪组织中，而不是在细胞质中。而且乙醇摄入停止后，酶的活性下降了很多，说明FAEEs合成酶的活性受到是否存在乙醇外源性介质的影响[19]。
Tony等[20]研究表明，FAEEs合成酶以细胞质和微粒的形式存在，并产生其他的活性。细胞质FAEEs合成酶的活性体现在使用乙醇和游离脂肪酸作为底物，合成FAEEs，被称为FAEEs合成酶；微粒FAEEs合成酶的活性体现在使用乙醇和脂肪酰基辅酶A为底物，被称为酰基辅酶A:乙醇酰基转移酶(AEAT)。
3 脂肪酸乙酯作为乙醇摄入的标记物
很早以前，人们就知道血液中乙醇可以作为乙醇摄入的标记物，但是血液中乙醇在体内会很快被降解，因此，需要一个指标可以用来作为乙醇摄入的长期标记物，在玻璃化温度条件下的乙醇浓度可能作为乙醇摄入的长期标记物，但是这也只是一种假设[21]。乙醇摄入后血液中的FAEEs浓度保持时间长达24h，FAEEs在血液中消失的衰减曲线与血液中乙醇的衰减曲线相似[22-23]。而FAEEs的消除是个非常缓慢的二级反应，所以在酒精摄入24h后，FAEEs仍存在于血液中，这些数据使人们得出结论：血液、头发中的FAEEs能够被用作酒精摄入的长期标记物[24]。
FAEEs一般被运送到血液中脂蛋白和白蛋白的核心。在脂蛋白核心的FAEEs迅速转变成磷脂双层[19]；当血液中FAEEs浓度较低时，其主要存在于白蛋白中，白蛋白携带FAEEs的能力很强；随着血液中FAEEs浓度进一步增加，脂蛋白携带的FAEEs浓度亦会增大。
人们了解到，白蛋白、极低密度脂蛋白(VLDL)、LDL和高密度脂蛋白(HDL)均可以刺激FAEEs，使之从细胞中释放入血液，并且当细胞暴露在乙醇环境中时，乙醇可诱导FAEEs的合成。摄入相同量的酒精浓度，在女性体内乙醇浓度要低于男性，FAEEs峰浓度显示，同等体质量的男性与女性相比，前者体内FAEEs浓度比后者高两倍多[24]。进一步的研究显示，慢性酒精中毒患者体内比急性酒精中毒患者体内的油酸乙酯含量高。因此，有研究者[25]尝试证明是否可以用体内油酸乙酯含量的高低来区分慢性酒精中毒和急性酒精中毒。这个实验结果显示，慢性酒精中毒患者和急性酒精中毒患者的体内油酸乙酯浓度有显着差异，前者体内的油酸乙酯浓度显着高于后者；油酸乙酯浓度的峰值出现的时间与乙醇的浓度峰值出现的时间相近。
由于乙醇在体内代谢快，故在车祸事故发生后通过乙醇浓度来评价是否有酒精摄入并不可靠[26]。所以人们开始尝试检测器官组织中FAEEs的浓度，以FAEEs作为酒精摄入的标志物。实验中，给大鼠的腹膜间注射乙醇，然后让其存活直至死亡，获取腹膜间脂肪和肝组织，发现肝脏和脂肪组织中均含有FAEEs[27]。人体心脏肌肉内的FAEEs的正常浓度低于0.001μmol/L，但是在尸检过程中却发现，不管是慢性酒精中毒患者还是急性酒精中毒患者，其心脏肌肉内的FAEEs浓度都达到了115μmol/L[26]。Bhupendra等[28-29]等测定了39位病人血液样本中FAEEs的浓度，并且考察了FAEEs浓度与体内酒精浓度的关系，其中41～50岁年龄范围的病人FAEEs浓度最高，但性别差异不明显。在大多数患者中检测到的主要FAEEs为棕榈酸乙酯和油酸乙酯，并且FAEEs的浓度随着血醇浓度的增加而增加，但是相比较而言, 急性酒精中毒患者比慢性酒精中毒患者的FAEEs浓度低(分别为4250、15086ng/mL)。没有任何慢性酒精摄入患者检测不出FAEEs，因此，FAEEs是一个可以作为慢性酗酒者体内乙醇摄入更加可靠的标志物。
4 FAEEs的分析测定
如果将血液中FAEEs作为乙醇摄入的标记物，则样品中FAEEs的稳定性是一个非常重要的问题。对人体血液中FAEEs进行分析，研究收集容器、贮藏时间和贮藏温度这些因素对血液中FAEEs浓度的影响[5]，结果显示，室温条件下4h内需要分离出细胞血浆和血清，然后4h后需要将细胞血浆和血清进行冷冻保存，以方便后续的分析检测。还发现在装有EDTA溶液的真空管中FAEEs的含量极少，以至于不能用于分析，这是因为有一个未知的机制降低了FAEEs的浓度。
人在摄入大量酒精后，FAEEs在人体循环中含量大多在50nmol/L～3μmol/L之间，测定低浓度的FAEEs需要灵敏度高和特异性强的检测方法，例如气质联用(GC-MS)。目前GC-MS采用与FAEEs极性相反的聚乙二醇和ZB-WAX毛细管柱来测定FAEEs，整个过程需要30～40min。Clark等[30]利用丙酮沉淀、正己烷提取，氨基丙基硅胶固相萃取法从血清中分离出FAEEs。Politi等[27]利用非极性的二甲基聚硅氧烷柱进行GC-MS分析，对人血浆中FAEEs的峰具有很好的分离度，而且检测时间缩短了60%以上，检测下限降到5～10nmol/L，定量下限为60nmol。测量总FAEEs的批内精密度(RSD)低于7%。Kwak等[31]用反相HPLC- MS-MS法检测人类胎粪中的FAEEs含量，在正离子模式下通过ESI-MS-MS和多反应监测(MRM)进行分离和定量，测定0.33nmol/g的亚油酸乙酯时，FAEEs的绝对回收率为(55±10)%，而当测定1.55nmol/g十四烷酸乙酯时，FAEEs的绝对回收率提高到了(86±8)%。检测限和定量限的范围分别是0.01～0.08nmol/g和0.02～0.27nmol/g[32]。
5 结 语
乙醇非氧化代谢产物FAEEs不仅可以作为长期摄入酒精的标记物，还可能作为判断急性酗酒和非急性酗酒的重要指标，其在人体器官中以在胰腺中含量最高，此外在肝脏、心脏和大脑等器官中亦有较低浓度的FAEEs存在，并且对于胰腺炎的症状产生和复发有很大的促进作用。酗酒可产生过多的FAEEs，虽然人们对其毒害作用的认识在不断深化，但对于FAEEs的细胞毒性和由此造成的器官损伤作用机制并不十分清楚，需要做进一步更深入的研究。在一些生物标记物中，因为FAEEs的高灵敏度和特异性，对头发中FAEEs的测定，并以此来估计人体内的酒精摄入量，已成为了目前最常用的方法，然而，对于FAEEs的测定大多都采用GC、MS等大型仪器，并且样品的制备过程较为繁琐[27]，因此，对于能够寻找一种简便、快速、灵敏的检测FAEEs浓度的方法亦是今后的研究热点。
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Research Advance in Non-Oxidized Metabolic Products of Ethanol: Fatty Acid Ethyl Esters
LI Jiang-tao，ZHANG Jiu-liang，HE Hui*，NIE Zhi-kui，MA Zhi-li
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
Fatty acid ethyl esters (FAEEs), as the non-oxidized metabolic products of ethanol, play an important role in ethanol-induced organ damage and can serve as the long-term markers of ethanol intake. The toxicity of FAEEs in vivo, the extraction of enzymes associated with FAEEs and the detection of FAEEs are summarized in this paper. In addition, the evidence of FAEEs as alcohol intake markers is provided as well.
fatty acid ethyl esters；non-oxidized metabolic product；markers of ethanol intake；cytotoxicity
Q591.9
A
1002-6630(2013)03-0290-04
2011-12-09
国家自然科学基金项目(30972043)；国家“863”计划项目(2008AA10Z314)
李江涛(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为食品化学和天然产物化学。E-mail：ljthyd@yahoo.com.cn
*通信作者：何慧(1960—)，女，教授，博士，研究方向为食品化学和天然产物化学。E-mail：hehui@mail.hzau.edu.cn
