樊 艳，李浩丽，郝怡宁

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏 南京 210023）

腐乳是一种微生物发酵大豆制品[1]，按其色泽可以分为红腐乳、白腐乳、青腐乳和各种花色腐乳，其中红腐乳因其色泽鲜艳、口感醇厚和气味愉悦，深受消费者喜爱。腐乳的滋味和香气是衡量其质量的重要指标之一，对腐乳的风味物质展开研究，不仅能够指导其加工工艺的优化，还有助于提高产品质量，进而提升其被消费的接受度。

滋味物质大多是水溶性、非挥发性的化合物[2]，电子舌是近年发展起来的一种用于分析滋味物质的新型检测手段[3-4]，目前使用电子舌研究腐乳滋味的报道较少。挥发性组分研究的前处理方法主要有液液萃取、同时蒸馏萃取[5-6]、顶空吸附等[7]。固相微萃取（solid-phase microextractio，SPME）是一种无溶剂样品前处理技术，操作简单、用时短[8]，被广泛应用于风味物质的研究，但鲜见应用于腐乳挥发性组分研究的报道。SPME和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）联用在挥发性物质的分析和未知化合物的鉴定方面有非常理想的效果[9]。

本研究以自制霉腐乳和市购腐乳为研究对象，采用电子舌结合氨基酸自动分析仪比较腐乳样本的整体滋味和主要呈味物质的异同；采用SPME提取挥发性组分，同时对萃取头进行比较选择，利用GC-MS结合保留指数（retention index，RI），对样本中的挥发性组分进行定性和定量以及风味物质的分析和比较，为霉腐乳的研发和生产提供基础性数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

4 种腐乳样本：2 种为毛豆腐制得的霉豆腐乳，编号为M1（腐乳毛霉菌种），M2（菌种同M1）；2 种为市购红方腐乳，编号分别为C1（氨基氮质量分数为1.120%）、C2（氨基氮质量分数为0.921%）。

10%三氯乙酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；500 mg/L正构烷烃（C7～C40）混合标准品 美国o2si公司；正己烷（色谱纯） 德国CNW公司；H型氨基酸混合标准品、茚三酮试剂以应液 日本和光纯药工业株式会社；氨基酸分析用缓冲液 日本三菱化学株式会社；去离子水（色谱级）由美国Millipore纯水机制备。

1.2 仪器与设备

PHS-3C酸度计 上海雷磁仪器厂；GL-6250A磁力搅拌器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Avanti J-26XP离心机 美国贝克曼公司；ASTREE电子舌（包含ASH、CTS、ANS、NMS、SCS、PKS和CPS 7 个味觉传感器和1 个Ag/AgCl参比电极） 法国Alpha M.O.S公司；7890A-5975C GC-MS联用仪 美国Agilent公司；MPS XT多功能样品处理平台 德国Gerstel公司；L-8900型氨基酸分析仪 日本株式会社日立制作所；SPME萃取头类型见表1，购自美国Supelco公司。

表1 SPME萃取头类型Table 1 SPME fibers used in this study

1.3 方法

1.3.1 霉腐乳样品的制作

2 000 g老豆腐，切成4 cm×4 cm×1.5 cm小方块，上锅蒸5min后放置凉透。称取15 g毛霉菌菌粉，加入500 mL水，搅拌均匀，把切好的豆腐块以1 cm均匀间隔摆放在蒸锅上，喷洒配制好的菌液，锅底加水，盖好盖子，温度15～25 ℃，相对湿度不低于50%，1 d开始长毛，发酵3 d后的毛豆腐用于制作霉豆腐乳。称取1 000 g毛豆腐，晾干，蘸取40 g的52°白酒，包裹50 g盐、15 g辣椒粉和1.6 g花椒粉[11]，入瓶，于阴凉处避光密封储存一周即可食用，存储后期M1样品添加食用油封面，M2未用油封面。

1.3.2 腐乳滋味的电子舌检测

4 个腐乳样本，每个样本3 组平行，每组平行样称5 g（精确到0.01 g），加50 mL水搅拌并超声20 min，10 000 r/min离心20 min，过滤，滤液倒入电子舌样品杯中，和洗液（超纯水）间隔放在样品盘上，采集频率为120 s/次，每个样重复检测6 次，取后3 次稳定的检测数据进行分析（传感器响应值会有一定程度波动[12]）。

1.3.3 游离氨基酸的检测

样本冷冻干燥后，研磨成粉，称取0.2 g（精确到0.001 g）于试管中，加入5 mL 10%三氯乙酸溶液，沉淀样本中多肽和蛋白质，摇匀后存于4 ℃环境中，每隔10 min摇匀1 次，2 h后取出，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液稀释2 倍后，上全自动氨基酸分析仪测试。

1.3.4 腐乳气味的SPME-GC-MS检测

SPME条件[13]：精确称取3 g样品于20 mL顶空瓶中，MPS保温箱温度60 ℃，平衡时间10 min，萃取时间30 min，解吸时间300 s，萃取头老化温度260 ℃，老化时间30 min。

GC条件[13-14]：DB-5 MS色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；载气为氦气（纯度≥99.999%）；流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；不分流进样；升温程序：柱温35 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升温到80 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升温到200 ℃，保持20 min。

MS条件：电子电离源；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；采集模式为全扫描（Scan）；质量扫描范围30～450 u。

RI测定：取正构烷烃混合标准品，稀释100 倍，按GC-MS条件进行分析，进样量1 μL，分流比10∶1，溶剂延迟时间5 min，样品中各挥发性组分的RI根据式（1）[15]计算：

式中：tx为待测组分的保留时间/min；tn为碳原子数为n的正烷烃（tn＜tx）保留时间/min；tn+1为碳原子为n+1的正烷烃（tx＜tn+1）保留时间/min。

定性和定量：匹配度不小于90，按烷烃标准品数据信息计算RI[16-17]，并与其他文献测定的RI进行对比确认，对样品的挥发性组分进行定性；采用峰面积归一化法进行定量，计算得到各组分的相对含量。选择挥发性组分的总峰面积和峰数量为考察指标，比较不同萃取头对样品挥发性组分萃取效果的影响。

1.3.5 PCA和TAV分析

判别指数（discrimination index，DI）为进行主成分分析（principal component analysis，PCA）时样品区分程度的表征值，当DI在80%～100%时说明区分有效[18]。采用滋味活性值（taste active value，TAV）评价组分对滋味的贡献度，TAV以映了各呈味化合物对样品滋味的贡献程度，在评价单个组分对整体风味的贡献时，TAV是最经典、客观的方法[19]，其值按式（2）计算[20]。当TAV＜1时，该组分对整体滋味贡献不明显，当TAV≥1时，该组分具有滋味活性，可能对样本整体滋味具有显着性贡献，且值越高，贡献越大[21]。

1.4 数据处理

采用Excel 2007和Origin pro 2018C软件制表和绘图，采用Origin pro 2018C软件进行PCA和聚类分析，采用MSD ChemStation软件处理SPME-GC-MS数据，未知挥发性组分与NIST08.L标准谱库进行匹配。

2 结果与分析

2.1 电子舌检测及传感器响应值的分析

如图1所示，自制的霉腐乳（M1）和市购2 种腐乳（C1、C2）口感较为接近，发酵后期的霉腐乳（M2）的苦、酸味值都远高于其他3 种腐乳，原因为在贮存后期未添加食用油封面，离开汁液的腐乳暴露在空气中逐渐褐变造成的。

图1 腐乳电子舌传感器响应雷达图Fig. 1 Radar diagram of electronic tongue sensor responses to fermented bean curd

图2 基于电子舌的腐乳PCAFig. 2 Principal components analysis score plot of fermented bean curd based on electronic tongue sensor responses

由图2可知，PC1和PC2对总体方差的累计贡献率达到了99.97%，满足大于85%的界限[22]，说明PC1和PC2几乎包含了样本的所有信息，可以以映出腐乳的整体滋味信息，其中PC1的方差贡献率远高于PC2，说明腐乳滋味在PC1上差距比PC2大[23]。DI值为98%，表明4 个腐乳样本差异明显，能够用电子舌较好地区分，后期发酵霉腐乳（M2）和另外3 种腐乳相距很远，与图1结果相似。

2.2 腐乳中的游离氨基酸组成

腐乳中的游离氨基酸主要是在其发酵过程中由蛋白质分解产生的[24]，不同的氨基酸组成和含量赋予腐乳丰富的味觉层次，使其具有鲜美、醇和、浓郁、柔润的滋味特征[25]。按游离氨基酸的呈味特征[26-27]，将17 种游离氨基酸分为鲜、甜、苦味3 组。如表2所示，4 种腐乳样本中含有丰富的游离氨基酸，在检测的17 种氨基酸中，除了Cys在C1和C2中未检测到，其余氨基酸在4 个样本中均有被检出。有研究[28]表明，Glu（鲜味）、Asp（鲜味）、Ala（甜味）、Met（苦味）和Lys（苦味）是发酵豆制品中主要的游离氨基酸。M1中游离氨基酸总量最大，鲜味氨基酸含量最大，对滋味贡献大的氨基酸依次为Glu、Val、Ala、His、Lys、Pro、Phe、Ile、Asp和Leu；M2中苦味氨基酸含量最大，该结论与电子舌分析结果一致，但苦味氨基酸含量过高会带来不良风味，影响腐乳整体口感，对滋味贡献大的氨基酸依次为Glu、Lys、Val、Ala、Ile、Phe、Tyr、Met、Asp、Leu、Gly、His和Arg；C1中游离氨基酸总量最小，可能是腐乳配方中的某些环境因素降低了蛋白酶系的活力，导致蛋白质分解成短肽和氨基酸的能力下降，鲜味氨基酸含量最大，对滋味贡献大的氨基酸只有Glu；C2中苦味氨基酸含量最大，对滋味贡献大的氨基酸依次为Glu、Val、Ala、Tyr、Lys、Phe、Met、His、Asp、Ile、Leu、Ser、Pro和Gly，与M2相似，但TAV相对较小。4 种腐乳中对滋味贡献最大的氨基酸均为Glu，Yamaguchi等[29]研究Glu是类似味精的鲜味物质，与其钠盐提供鲜味，因此4 种腐乳独特的滋味和鲜味氨基酸组分有一定关系。

2.3 SPME-GC-MS挥发性成分的分析

2.3.1 萃取头对萃取效果的影响

不同萃取头涂层的极性不同导致其吸附的组分种类和极性不同[32-33]。由图3可知，不同萃取头对腐乳的萃取效果存在显着差异，其50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头得到的组分的总峰面积和峰数量都是最大的，因此，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头用于腐乳挥发性组分的测定分析。

图3 萃取头类型对腐乳挥发性组分萃取效果的影响Fig. 3 Effect of extraction fibers on the extraction efficiency of volatile compounds from fermented bean curd

2.3.2 腐乳挥发性组分的分析

经GC-MS检测，发现4 种腐乳挥发性组分复杂，本研究所采用的分析条件能较好地分离这些组分。按NIST08.L标准库检索，结合RI对腐乳中的挥发性组分进行的鉴定，结果见表3。4 种腐乳共鉴定出73 种挥发性组分，其中M1共鉴定出38 种，萜烯类占53.06%、芳香族占20.68%、醇类占9.00%、酯类占4.99%、烷烃类占4.11%、含氮化合物占2.53%、烯烃类占1.92%、酮类占1.60%、萘类占0.46%；M2鉴定出31 种，芳香族占55.72%、萜烯类占24.07%、烷烃类占7.51%、醚类占4.95%、醇类占3.89%、酯类占1.96%、烯烃类占1.05%、萘类占0.84%；C1共鉴定出27 种，醇类占59.19%、芳香族占25.17%、酯类占13.79%、萜烯类占1.40%、萘类占0.41%、烷烃类占0.04%；C2共鉴定出14 种，醇类占59.45%、酯类占40.40%、芳香族占0.12%、烷烃类占0.02%。M1中萜烯类和芳香族化合物的相对含量较高，M2中芳香族和萜烯类化合物的相对含量较高；C1中醇类和芳香族化合物的相对含量较高，C2中醇类和酯类化合物的相对含量较高。

表2 腐乳中游离氨基酸组成和含量及其对应的TAVTable 2 Contents of free amino acids in fermented bean curd and their TAVs

表3 4 种腐乳挥发性组分的分析结果Table 3 Analysis of volatile compounds in four fermented bean curds

续表3

腐乳发酵过程中，氨基酸和汤料中的乙醇发生一系列复杂的生化以应产生酯类、醇类和醛类等挥发性风味物质[35-36]。小分子质量的酯类物质具有独特的气味，如水杨酸甲酯（M1相对含量2.48%）、癸酸乙酯（M1相对含量0.15%、C1相对含量0.67%、C2相对含量0.05%）、3-苯丙酸乙酯（C2相对含量0.03%）有水果味及其他诱人的风味；大分子质量的酯类虽然气味阈值高，香味弱，但含量高也可以产生特有的风味，如棕榈酸乙酯（C1相对含量8.75%、C2相对含量21.34%）有微弱果爵和奶油香味，9-十八酸乙酯（C2含7.80%）有淡淡的花味[37]。M1中萜烯类和芳香族化合物的相对含量较高，有可能是加入香辛料的原因，其中3-蒈烯的相对含量为43.45%，3-蒈烯多用于食用香精的配方[38]，M2中的3-蒈烯的相对含量也超过了10%，M1和M2中萜烯类化合物相对含量均高于C1和C2的萜烯类化合物含量，一定程度上说明M1和M2在生产中使用的香辛料用量大于C1和C2的香辛料用量。具有茴香特殊香气[39]的茴香脑在M1、M2和C1中均被检测到，相对含量分别为11.81%、44.91%和22.15%。具有玫瑰香气的苯乙醇在M1中的相对含量为7.95%。C1和C2中乙醇的相对含量都超过了50%，酒香明显，应该是蛋白质等物质在发酵过程中分解产生的醇类物质增加[39-40]，这与王伦兴等[41]的研究结果一致。刘娜等[42]采用顶空SPME-GC-MS-嗅闻法测定红腐乳挥发性风味物质，结果表明乙醇和酯类化合物是其主要贡献成分。穆旻等[5]对红腐乳中挥发性成分的提取和分析鉴定出的76 种挥发性成分中酯类有30 种、醇类10 种，与本实验测得的C1和C2的结果一致，2 种样品中醇类和酯类占比不同，可能与2 种红腐乳的生产工艺条件差异相关。M1和M2中烷烯类物质可能是脂肪分解产生的[6]，但由于其风味阈值较高，故对腐乳的总体风味贡献不大。

2.3.3 PCA结果

运用Origin pro 2018C软件对4 种腐乳样本挥发性成分的相对含量进行PCA，由结果可知，PC1贡献率为48.65%，PC2贡献率为42.75%，PC3贡献率为6.56%，PC4贡献率为2.04%，累计贡献率为100%。如图4所示，4 种腐乳中M1和M2分布在第2象限，与其相关性较高的挥发性组分是G10（3-蒈烯）和G9（1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-环己二烯）；C1和C2分布在第1象限，与其相关性较高的挥发性组分为G67（棕榈酸乙酯）、G1（乙醇）和G20（茴香脑）。

图4 4 种腐乳的主成分双标图Fig. 4 PCA score plots and loading plots of four fermented bean curds

2.3.4 聚类分析结果

图5 4 种腐乳的聚类分析树状图Fig. 5 Clustering dendrograms of four fermented bean curds

由图5可知，当4 种腐乳在类间间距为40时，腐乳样本分为2 类，第1类为M1和M2，第2类为C1和C2；当类间间距为30时，腐乳样本分为3 类，第1类为M1，第2类为M2，第3类为C1和C2。聚类分析结果和GC-MS检测结果一致。

3 结 论

本实验采用电子舌和SPME-GC-MS结合化学计量学方法对4 种不同品牌腐乳的滋味和挥发性组分进行研究，比较自制霉腐乳和市售腐乳在滋味和风味上的异同。结果表明，电子舌传感器响应雷达图和PCA图能看出4 个腐乳样本差异明显，能够用电子舌较好地区分，自制霉腐乳（M1、M2）的滋味特征有别于其他2 种；氨基酸分析结果表明4 种腐乳样本中Glu的TAV最大，自制霉腐乳M1中鲜味氨基酸含量最大，M2中苦味氨基酸含量最大，此结果和电子舌分析结果一致；SPME-GC-MS共鉴定出73 种挥发性组分，其中酯类、醇类、萜烯类和芳香族类化合物相对含量较高，是构成腐乳香气的主要成分，自制霉腐乳中萜烯类和芳香族化合物的相对含量较高。利用PCA法得到的双标图中可知自制霉腐乳M1和M2分布在同一象限，与其相关性较高的挥发性组分为3-蒈烯和1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-环己二烯；利用聚类分析能看出不同腐乳之间的亲疏远近，其中自制霉腐乳M1和M2的挥发性成分最为接近。本研究结果为霉腐乳的研发和生产提供基础性数据，3 种研究方法互为辅助，结合使用会使结果更全面、可靠。