基于转录组分析氯化钙对青圆椒采后机械损伤品质的影响

周新原，桑兆泽，白春美，郑鄢燕，贾丽娥，王 清，左进华，牟建楼

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001；2.北京市农林科学院农产品加工与食品营养研究所，农业农村部蔬菜产后处理重点实验室，果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室，北京 100097；3.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121013）

青圆椒（Capsicum annuumL.）为茄科、辣椒属植物，富含胡萝卜素和VC等营养物质，具有抗氧化、延缓衰老的作用，此外，还具有镇痛、解热、预防癌症、促进消化和加速脂肪代谢的保健作用，因此青圆椒是世界范围内重要农业经济作物[1-2]。青圆椒在运输过程中易发生挤压、坠落、磕碰等情况，造成不可避免的机械损伤，使得青圆椒果实的组织结构遭到破坏，使其极易受到病菌侵害，加速腐烂变质，促进衰老进程，导致其商品价值和食用价值下降[3]。本实验不仅探究了氯化钙对采后青圆椒机械损伤后在贮藏过程中果实品质的影响，并为以后从分子层面探究果蔬贮藏保鲜的研究提供了方向。钙离子是植物细胞膜和细胞壁的重要组成部分，对于维持细胞膜功能正常和细胞壁结构稳定具有重要作用[4]。氯化钙无毒、无味、味微苦，是果蔬采后钙处理常用的钙盐[5]。刘瑶等[6]研究了氯化钙处理对机械损伤番茄果实生理特性的影响，发现氯化钙处理可以维持机械损伤番茄在贮藏期间的感官品质，降低腐烂率，延长货架期。王云香等[7]通过1-甲基环丙烯处理受到机械损伤的青圆椒，发现其可以有效延缓采后机械损伤青圆椒的衰老进程，保持果实的贮藏品质，延长青圆椒果实的货架期。李琪等[8]以琯溪蜜柚为试材，通过对果实进行跌落及划伤处理，研究不同机械损伤处理对果实的损伤程度差异及其对果实贮藏生理品质的影响，实验结果表明，划伤及跌落伤都会对琯溪蜜柚正常生理代谢产生影响，使果实衰老进程加快，严重影响正常生命代谢活动，而且同种伤害时，伤害程度越大，果实贮藏品质越低。陈娟娟等[9]探究氯化钙和水杨酸结合处理对辣椒冷藏过程中贮藏品质的影响，其研究结果表明辣椒采后用质量分数1%的氯化钙溶液处理会降低质量损失，抑制辣椒中VC含量的下降，提高辣椒的感官评分。目前，对于果蔬贮藏保鲜的研究大多停留在表观生理生化实验，而对于其分子层面的研究较少。本研究通过高通量测序技术对青圆椒转录组进行测序分析，以青圆椒的质地、色泽、风味香气、植物激素和转录因子作为切入点，筛选关键基因，并对其进行分析，旨在为青圆椒采后贮藏及运输提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘京甜三号’青圆椒采收于北京延庆区东小营村。

聚乙烯保鲜袋（40 cm×30 cm，厚度0.03 mm）北京华盾雪花有限公司；氯化钙 北京化学试剂公司；RN40 RNA提取试剂盒 北京艾德莱生物科技有限公司；RNA Nano 6000试剂盒 美国安捷伦公司；带有Oligo（dT）的磁珠、Fragmentation Buffer 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 仪器与设备

CR-300色差计 日本 Konica Minolta公司；XMTD-6000型数显恒温水浴锅 余姚金电仪表有限公司；GY-2型硬度计 浙江托普仪器有限公司；YP20002型电子天平余姚市金诺天平仪器有限公司；NanoDrop 2000超微量分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 青圆椒处理方法

挑选色泽呈深绿色、大小一致、果实充分膨大、无机械损伤、无病虫害且达到商业成熟度的青圆椒果实进行实验。为模拟在运输中受到机械损伤的青圆椒，采用高处坠落法将筛选后的青圆椒在1 m高处进行自由落体运动，挑选坠落后无开裂的青圆椒分为2 组，对照组50个青圆椒用去离子水浸泡20 min，氯化钙处理组50个青圆椒用1 mmol/L的氯化钙溶液浸泡20 min。然后将两组青圆椒取出晾干，装入聚乙烯保鲜袋于20 ℃下贮藏，于0、2、4、6、8、10、12 d取样，留取3个青圆椒果实进行感官评价，剩余样品立即用液氮冷冻后置于-80 ℃贮藏。

表1 青圆椒感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of green bell peppers

1.3.2 感官评价方法

由经过标准培训的10 名人员（5 男5 女）组成品评小组，取青圆椒果实根据表1进行评分，感官评分越高，说明该青圆椒的感官品质越好。评分1～3 分为不可接受，4～6 分为品质一般，7～9 分为商品价值较高。

1.3.3 硬度测定

采用GY-2型数显水果硬度计进行测定，探头直径为0.8 cm，每次选取3个果实（不去皮），在青圆椒赤道位置选取3个点，探头穿透青圆椒测得相应的硬度，取平均值。

1.3.4 色泽测定

采用CR-300色差计测定青圆椒果实色泽，每组选取3个青圆椒果实，在青圆椒果实的赤道位置选取3个点，测定其a*（红绿度）、b*（黄蓝度）和L*值（明亮度）。

1.3.5 转录组分析

取对照组贮藏第0、12天样品（分别记为CK 0和CK 12）、氯化钙处理组贮藏第12天样品（记为氯化钙12）进行转录组分析。参照RNA提取试剂盒说明书提取青圆椒RNA。采用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度。采用RNA Nano 6000分析试剂盒分析RNA完整性。

样品检测合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；加入Fragmentation Buffer将mRNA进行随机打断；以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA Polymerase I合成第二条cDNA链，利用AMPure XP beads纯化cDNA；纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择；最后通过聚合酶链式反应富集得到cDNA文库。采用实时荧光定量聚合酶链式反应对文库的有效浓度（＞2 nmol/L）进行定量，以保证文库质量。采用高通量测序技术进行测序。

差异倍数（fold change，FC）表示两组样品间基因相对表达量的比值。以FC≥2且错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.01作为差异基因筛选标准。根据美国国家生物技术信息中心非冗余蛋白质序列（non-residual protein sequence，Nr）、蛋白质家族（Pfam）、同源蛋白质组簇（KOG/COG）、人工注释和审查的蛋白质序列数据库Swiss Prot、京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和基因本体论（gene ontology，GO）6个数据库对差异基因功能进行注释。

1.4 数据处理与分析

实验设置3个平行，结果以平均值±标准差表示。采用Origin软件作图，采用Excell软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 氯化钙处理对青圆椒感官品质的影响

果蔬的感官品质是影响消费者购买决策的第一指标，新鲜的青圆椒色泽鲜亮莹绿，质地脆硬，水分充足，整体饱满。如图1所示，青圆椒在贮藏期间感官评分总体呈下降趋势，但氯化钙处理后的青圆椒感官评分始终高于对照组。由此可知，氯化钙浸泡处理后可延长机械损伤青圆椒的贮藏期，维持其感官品质。

图1 氯化钙处理对青圆椒感官品质的影响Fig. 1 Effect of CaCl2 treatment on the sensory quality of green bell peppers

2.2 氯化钙处理对青圆椒硬度的影响

硬度是评价青圆椒品质的重要指标之一，质地过软，则容易腐烂变质，口感较差，影响消费者购买欲望。如图2所示，青圆椒的硬度随贮藏时间的延长而逐渐降低，并且在贮藏期间1 mmol/L氯化钙处理后的青圆椒硬度均高于对照组。在贮藏12 d时对照组的青圆椒硬度相比0 d时下降了28.49%，而氯化钙处理后的青圆椒硬度仅下降了18.47%。结果表明，1 mmol/L的氯化钙处理可有效延缓机械损伤青圆椒的硬度降低。

图2 氯化钙处理对青圆椒硬度的影响Fig. 2 Effect of CaCl2 treatment on the hardness of green bell peppers

2.3 氯化钙处理对青圆椒色泽品质的影响

果实的色泽是青圆椒重要外观指标之一，新鲜的青圆椒颜色翠绿光亮，随着青圆椒的成熟和衰老，青圆椒的颜色则由翠绿转为暗绿色或者变为红色。如图3A所示，在贮藏期间CK组与氯化钙处理组的a*值呈上升趋势，表明青圆椒由翠绿色开始逐渐变化，且氯化钙处理后的青圆椒a*值均略低于CK组（P＜0.05），说明氯化钙处理可以较好地维持青圆椒的翠绿色，延缓青圆椒的转色与衰老。如图3B所示，两组青圆椒的b*值在贮藏期内呈逐渐增加的趋势，即黄色加深，0～6 d两组青圆椒b*值无明显差异，贮藏第8天时氯化钙处理组青圆椒的b*值则低于CK组。如图3C所示，两组的青圆椒L*值基本呈波动下降的趋势，与CK组相比，氯化钙处理组L*值变化幅度较小。结果表明，青圆椒经氯化钙处理后受到机械损伤仍可较好地维持其原有色泽。

图3 氯化钙处理对青圆椒a*（A）、b*（B）、L*（C）值的影响Fig. 3 Effect of CaCl2 treatment on a* (A), b* (B) and L* (C) values ofgreen bell peppers

2.4 氯化钙处理的青圆椒差异基因比较分析结果

对照组贮藏12 d前后（CK 0 vs CK 12）的差异基因表征了经机械损伤青圆椒在贮藏过程中一系列基因变化，而贮藏12 d后对照组和氯化钙处理组（CK 12 vs 氯化钙12）的差异基因则表征了氯化钙处理对机械损伤青圆椒果实贮藏后一系列基因表达的影响。CK 12 vs氯化钙12中共有596个重复基因，其中336个基因相对表达量上调，260个基因相对表达量下调，通过功能鉴定分析这些基因对果实质地变化、色泽积累、风味物质变化、植物激素的产生和转录因子的影响。

2.4.1 氯化钙处理对青圆椒色泽相关基因表达的影响

果实颜色的呈现与类胡萝卜素的合成代谢有关，共鉴定了14个与色泽相关的差异基因，包括编码双功能15-顺式八氢番茄红素合酶（bifunctional 15-cisphytoene synthase，PSY）、辣椒红色素/辣椒红色素合酶（capsanthin/capsorubin synthase，CCS）、β-胡萝卜素羟化酶1（beta-carotene hydroxylase 1，BCH1）、类胡萝卜素裂解双加氧酶4（carotenoid cleavage dioxygenase 4，CCD4）等的基因。如图4所示，与CK 0相比，CK 12中BCH1、CCS、PSY的相对表达量提高，其中PSY相对表达量提高了7.81 倍，CCS相对表达量提高了205.34 倍，BCH1相对表达量升高至CK 0的23.53 倍，CCD4相对表达量降低至CK 0的4.8%；而用氯化钙处理的青圆椒果实贮藏12 d后CCD4相对表达量较CK 12提高了18.68 倍，PSY相对表达量为CK 12的7.17%，CCS相对表达量为CK 12的1.25%，BCH1相对表达量为CK 12的5.01%。

图4 氯化钙处理对青圆椒色泽相关基因表达差异性分析结果Fig. 4 Differential expression analysis of color-related genes in green bell peppers treated with CaCl2

2.4.2 氯化钙处理对青圆椒质地相关基因表达的影响

贮藏期间共鉴定出68个与果实质地相关的差异基因。这些基因编码包括许多与细胞壁代谢有关的酶，如纤维素合酶A（cellulose synthase A，Ces）、多聚半乳糖醛酸酶2（polygalacturonase 2，PG2）、内切-1,3-β-葡萄糖苷酶4（endo-1,3-β-glucosidase 4，β-Glu）和内切葡聚糖酶25（endoglucanase 25，EG25）等，它们在细胞壁降解中起着重要作用[10-13]。从图5可以看出，与CK 0相比，CK 12的β-Glu、Ces和EG25相对表达量下调，PG2相对表达量上调；而氯化钙12的β-Glu、Ces和EG25等基因表达量的下调受到抑制，PG2相对表达量上调也受到抑制，与CK 12相比氯化钙12的β-Glu相对表达量增加了944.32%、Ces相对表达量增加了135.34%、EG25相对表达量增加了397.67%，PG2相对表达量降至CK12的2.83%。

图5 氯化钙处理对青圆椒质地相关基因表达差异性分析结果Fig. 5 Differential expression analysis of texture-related genes in green bell peppers treated with CaCl2

2.4.3 氯化钙处理对青圆椒风味与香气相关基因表达的影响

风味和香气物质不仅影响果蔬的感官品质和营养品质，而且在一定程度内会影响消费者的选择[14]。果蔬的香气和风味主要与糖、酸、氨基酸、脂肪酸和类胡萝卜素等挥发性物质的合成相关[15]。本研究共鉴定出21个与果实风味和香气相关的差异表达基因。与CK 12相比，氯化钙12中有14个基因相对表达量下调，7个基因相对表达量上调。如表2所示，氯化钙处理有效抑制了贮藏期间亚油酸9S-脂肪氧化酶5、谷胱甘肽S-转移酶U7（glutathioneS-transferase U7，GSTsU7）和乙醇脱氢酶7（alcohol dehydrogenase 7，ADH7）、奇迹素基因相对表达量下调，抑制贮藏期间2-异丙基苹果酸合酶A（alanine aminotransferase 2，AlaAT2）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）等基因相对表达量上调。

表2 青圆椒风味与香气相关基因差异表达分析结果Table 2 Differential expression analysis of flavor and aroma-related genes in green bell peppers treated with CaCl2

2.4.4 氯化钙处理对植物激素相关基因表达的影响

乙烯、脱落酸、生长素和赤霉素等植物激素有助于调节果实成熟和衰老过程。本研究共鉴定出29个与植物激素相关的差异表达基因，其中包括参与乙烯生物合成参与植物激素信号传导途径的乙烯反应因子113（ethylene reaction factor 113，ERF113）、生长素反应蛋白16（auxin reaction protein 16，IAA16）、脱落酸8’-羟化酶1（abscisic acid 8’-hydroxylase 1，ABAH1）等。与CK 12相比，氯化钙12的15个差异基因相对表达量下调，14个差异基因相对表达量上调。从图6可以看出，与CK 0相比，CK 12的ERF113和IAA16相对表达量下调，ABAH1相对表达量上调，经过氯化钙处理后，与CK 12相比，氯化钙12的ERF113相对表达量提高了21.67 倍，IAA16相对表达量提高了13.82 倍，ABAH1相对表达量下降了62.42%。

图6 氯化钙处理对青圆椒植物激素相关基因表达差异性分析结果Fig. 6 Differential expression analysis of phytohormone-related genes in green bell peppers treated with CaCl2

2.4.5 氯化钙处理对青圆椒贮藏保鲜过程中涉及转录因子表达的影响

青圆椒在贮藏保鲜过程中主要涉及的转录因子有ABC家族、bHLH、ERF、WRKY、NAC、MYB等。R2R3-MYB转录因子家族成员直接或间接靶向关键酶基因，能影响果实糖、酸、香味、黄酮类、单宁、木质素等物质合成和积累，调节了风味品质以及营养品质组成[16]。本研究共鉴定出53个与转录因子相关的差异表达基因。如图7所示，与CK 0相比，CK 12中bHLH149相对表达量下调，WRKY转录因子（WRKY transcription factor 75，WRKY75）、MYB108和含NAC结构域的蛋白质2（NAC domain-containing protein 2，NAC2）等基因相对表达量上调；而氯化钙处理可以明显减弱这些变化。经过氯化钙处理后，与CK 12相比，氯化钙12的bHLH149相对表达量升高了1.21 倍，WRKY 75相对表达量降低了41.64%，MYB 108相对表达量降低了53.22%，NAC2相对表达量降低了68.08%。

图7 氯化钙处理的青圆椒转录因子相关基因表达差异性分析结果Fig. 7 Differential expression analysis of transcription factor-related genes in green bell peppers treated with CaCl2

3 讨 论

青圆椒果实的颜色变化主要与类胡萝卜素和叶绿素的合成代谢相关，类胡萝卜素及叶绿素对青圆椒果实的颜色起着重要作用，叶绿素的降解，以及辣椒红素和β-胡萝卜素的合成，导致青圆椒的外观颜色从绿色变成红色[17]。已有研究表明，青圆椒由绿转红主要受CCS、PSY和BCH等基因的调控[18-20]。通过沉默CCS、PSY或BCH基因中的任何一种都可以直接或间接影响青圆椒中类胡萝卜素的积累[21]。在本实验中，未经氯化钙处理的青圆椒果实在贮藏过程中，CCS、PSY和BCH1等基因相对表达量大幅度提高，颜色表型也发生变化，而经过氯化钙处理的青圆椒果实中CCS、PSY和BCH1基因表达受到抑制，氯化钙处理延缓了青圆椒的转红速率，能够较好地维持青圆椒色泽。

软化是果实成熟衰老的标志之一，果实软化主要与细胞壁的降解相关，植物的细胞壁主要由纤维素和果胶组成，当细胞壁降解酶相互协调共同作用导致这两种物质发生降解时，果实也随之软化甚至发生腐烂[22-25]。有研究表明，果实的硬度与β-Gal和PG2活性呈极显着负相关，β-Gal和PG2活性越高，果实软化速度越快[26]。本研究贮藏期间，与CK 12相比，氯化钙12中β-Glu、Ces和EG25相对表达量上调，PG2相对表达量下调，细胞壁合成受到影响，氯化钙处理后，PG2相对表达量大幅度下降，因而延缓青圆椒的软化。本研究氯化钙处理可以通过抑制与细胞壁相关的酶基因的表达来延缓青圆椒果实的细胞壁降解和软化。

青圆椒的风味物质主要与萜类、甾体、苯丙酸、半胱氨酸等氨基酸和不饱和脂肪酸合成途径有关，香气成分主要与醇、醛、酯等挥发性物质的合成代谢相关[27-30]。有研究表明乙醛经乙醇脱氢酶催化生成乙醇，随后乙醇酯化产生酯类物，该类物质主要表现果香味、甜味，对果实风味形成有一定正向作用[31]。在本研究中，从CK 12与氯化钙12比较可以看出，氯化钙处理能够抑制AlaAT2和PAL等基因相对表达量上调，延缓ADH7、GSTsU7和亚油酸9S-脂肪氧化酶5等基因相对表达量下调。与CK 0相比，CK 12中ADH7相对表达量下调，果实正常香气风味的合成受到影响，与CK 12相比，氯化钙12中ADH7相对表达量上调，能够较长时间维持其正常风味，保持其品质。以上结果表明，氯化钙处理能够通过调节果实风味与香气相关酶基因的表达来影响香气与风味的变化，进而保持青圆椒原本的风味香气，减少不良气味的产生。

乙烯是影响呼吸跃变型果实成熟进程的重要激素物质，在果实采后贮藏过程中参与细胞壁降解导致果实软化，而青圆椒属于非呼吸跃变型果实，有研究表明乙烯在非呼吸跃变型果实中同样参与果实成熟衰老[32]。本研究青圆椒在贮藏期间，与CK 0相比，CK 12乙烯感知下游基因ERF113下调。而与CK 12相比，氯化钙12中的ERF113基因上调，ERF113可能与乙烯合成呈拮抗关系，表明氯化钙处理对青圆椒中乙烯合成相关酶进行调控，减少了乙烯的合成，从而延缓青圆椒的衰老和质地的软化。此外，有研究表明，乙烯、脱落酸能够促使贮藏期间薄皮甜瓜果实中PG、PME、β-Gal活性升高，以调节果实细胞壁多糖、果胶物质的变化，促进果实软化[33]。与CK 0相比，CK 12的ABAH1和PG2相对表达量上调，而与CK 12相比，氯化钙12中的ABAH1和PG2相对表达量下调，质地变软缓慢。Aux/IAAs和ARFs是生长素信号通路中的两个主要转录调节因子，生长素能够拮抗乙烯或脱落酸的影响来抑制果实成熟[34-37]。本研究中机械损伤青圆椒中的IAA16等相对表达量在氯化钙处理后有所提高，ABAH1相对表达量下调，与对照组相比，氯化钙处理组的青圆椒比对照组的青圆椒衰老较慢。由此可知，氯化钙能够对青圆椒果实中植物激素进行调控，并通过植物激素间的相互促进、拮抗作用，延缓青圆椒果实机械损伤带来的危害。

4 结 论

氯化钙处理不仅能够延缓水果品质的劣变、营养的流失还能延长其贮藏期，而且对于有机械损伤的水果，仍能起到很好的保鲜效果[38]。本研究使用氯化钙对受到机械损伤的青圆椒进行处理，分析其生理特性、营养品质及基因在贮藏期间的变化，发现氯化钙能够延长机械损伤青圆椒的贮藏时间，保持青圆椒的品质，有效维持青圆椒的硬度，降低其转红速率，对青圆椒的腐烂有抑制作用。此外，氯化钙可能通过抑制CCS和PSY等基因的上调来抑制类胡萝卜素的合成，通过抑制β-Glu、Ces和EG25等基因的下调来缓解其软化，并通过影响青圆椒中某些转录因子、植物激素和香气风味相关基因的表达，进而影改善有机械损伤的青圆椒果实的表观品质。