气态臭氧结合微孔气调包装对杨梅品质和抗氧化性能的影响

雷婷婷，殷 诚，孙陟岩，钱 静

（江南大学机械工程学院，江苏 无锡 214122）

杨梅（Myrica rubraSieb.et Zucc.）是我国重要的亚热带水果品种，其酸甜适中、营养丰富，同时富含酚类等多种天然活性成分，这些活性成分具有抗癌、抗氧化、减肥和神经保护特性，具有很高的营养价值和食疗作用[1-2]。杨梅成熟期约在每年的6、7月，恰逢梅雨季节，因其组织含水率高且无坚实外果皮保护，在采摘和运输中易受机械损伤，且采后活性氧（reactive oxygen species，ROS）代谢平衡易被破坏，导致杨梅在常温下仅可保存1～2 d[3-4]。

目前，常见的杨梅采后保鲜技术有热处理[5]、气调保鲜[6]、化学保鲜[7]、电场保鲜[8]等方法。其中气调包装（modified atmosphere packaging，MAP）被广泛用于杨梅[6]、树莓[9]和葡萄[10]等水果的保鲜。然而MAP中所用薄膜CO2的扩散速度比O2快2～8 倍，这种特性不适合呼吸频率高的果蔬，甚至在低O2和高CO2环境下，厌氧和产生异味是常见的现象[11-12]。为解决这些问题，微孔气调包装（perforated MAP，P-MAP）被用于果蔬的保鲜。Rodriguez等[13]研究表明，以孔径3 mm、孔数为2 个/1 856 cm2的低密度聚乙烯薄膜包装蓝莓，第7天时包装内可通过呼吸作用被动产生稳定气体比例，有效抑制蓝莓的腐烂；Liguori等[14]使用穿孔定向聚丙烯（polypropylene，PP）薄膜对葡萄进行包装，包装盒内初始CO2和N2体积分数分别为20%和80%，在整个贮藏期间包装内气体比例始终处于动态平衡，显着降低了葡萄的腐烂率。

臭氧是延长食品保质期的绿色冷保鲜技术，可以通过刺激细胞内的ROS代谢系统来提高植物的抗逆性，从而促进抗氧化酶的合成[15]。Yeoh等[16]用臭氧气体（ozone gas，OG）处理鲜切木瓜20 min，发现其总酚含量比未处理的对照组增加了10.3%。此外，研究人员已成功将臭氧预处理与MAP相结合，以降低呼吸速率并刺激抗氧化防御系统[17]，延长了蘑菇[18]、葡萄[19]和树莓[20]等新鲜果蔬的货架期。

本研究旨在基于上述研究探讨臭氧预处理协同P-MAP对杨梅的保鲜效果，筛选杨梅保鲜的最佳臭氧浓度和气体比例，并采用能够预测包装系统内气体浓度的数学模型来推导实现包装内气体组成平衡的微孔参数，最后探讨臭氧预处理结合P-MAP对杨梅品质和抗氧化性能的影响，为开发和完善杨梅保鲜技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用大浮杨梅于江苏无锡太湖采摘，采摘时排除任何有病害的个体，并在采后3 h内运回实验室。挑选无机械损伤、无病虫害、大小均匀、成熟度相当的杨梅作为实验材料。

浓盐酸、乙二胺四乙酸、30%过氧化氢、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、α-萘胺、硝酸钾、丙酮、四氯化钛、浓氨水、硫酸、磷酸、红菲咯啉、三氯化铁、乙二胺四乙酸二钠、蛋氨酸、氮蓝四唑国药集团化学试剂有限公司；交联聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮 北京伊诺凯科技有限公司；二硫苏糖醇上海百灵威化学技术有限公司；无水甲醇、L-抗坏血酸（ascorbic acid，ASA）上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

PLMAP-5包装系统（基于加压惰性气体和激光微孔膜的抑菌MAP）无锡一网激光设备有限公司；V-320多功能MAP一体机 苏州工业园区德森包装机械有限公司；UV-1800紫外分光光度计 日本岛津国际贸易公司；PAL-BX/ACIDF5糖酸度一体机 日本ATAGO公司；GY-5B数显水果硬度计 杭州艾普仪器设备有限公司；C650B顶空气体分析仪 济南兰光机电技术有限公司；LC-LX-HR165A高速冷冻离心机 上海一恒科学仪器有限公司；GN-S2S臭氧机 安徽杰禹电子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 臭氧处理和MAP实验

选择挑选后的杨梅随机分成6 组，3 组进行MAP处理，MAP的处理条件分别为：1）5% O2+15% CO2+80% N2（MAP 1）；2）10% O2+10% CO2+80% N2（MAP 2）；3）5% O2+10% CO2+85% N2（MAP 3）；3 组进行OG处理，处理时间为30 min，处理浓度分别为18.3、36.7、54.9 mg/m3。采用PP材质的MAP盒（183 mm×133 mm×80 mm），每盒装入（100±1）g杨梅后以聚对苯二甲酸乙二醇酯/聚丙烯（polyethylene terephthalate/polypropylene，PET/PP）聚合膜（243.39 cm2）进行热封。将包装好的杨梅置于（4±1）℃、相对湿度90%～95%的环境下贮藏，在贮存的第5天测定其理化指标，以未进行臭氧处理、初始气体为空气的普通包装作为对照组（CK）。

1.3.2 微孔参数的确定

呼吸速率遵循Benkeblia等[21]的方法进行测定，基于米氏方程通过多重线性回归分析推出呼吸模型。根据气调实验得到的杨梅最佳气体比例，将呼吸模型与硬盒包装微孔膜MAP模型[22]联立，可以获得使杨梅包装内气体组成维持动态平衡的微孔参数（表1）。考虑到激光机的最佳加工效果，选取孔径为100 μm的微孔进行实验。

表1 杨梅MAP膜微孔参数Table 1 Number and size of perforations in MAP film for Chinese bayberry

将杨梅置于MAP盒中，每盒装入（100±1）g杨梅后充入10% O2+10% CO2+80% N2并使用微孔PET/PP复合膜热封。不同包装处理组参数如下：1）孔径100 μm，孔数为0，记为MAP P0；2）孔径100 μm，孔数为2，记为MAP P2；3）孔径100 μm，孔数为4，记为MAP P4；将包装好的杨梅置于（4±1）℃、相对湿度90%～95%的环境下贮藏，每天测定一次包装顶部空间成分。

1.3.3 臭氧预处理结合微孔MAP实验

将杨梅置于MAP盒中，每盒装入（100±1）g杨梅，处理方法如下：用18.3 mg/m3的OG对杨梅处理30 min，立即进行MAP并以微孔膜热封（OG+MAP P2）；不经过臭氧处理直接进行MAP并以微孔膜热封（MAP P2）；以未进行臭氧处理、初始气体为空气的普通包装作为对照组（CK）。将包装好的杨梅置于（4±1）℃、相对湿度90%～95%的环境下贮藏，在贮藏期间每天测定一次杨梅理化指标。

1.3.4 包装内气体成分的测定

使用C650B顶空气体分析仪监测包装的顶部空间成分。将气体分析仪针头通过薄膜上的硅胶隔膜插入包装内测定O2和CO2的体积分数[21]。每组3 个平行，结果取平均值。

1.3.5 杨梅品质指标的测定

腐烂指数的测定参考Yang Zhenfeng等[23]的方法并稍作修改，以杨梅表面出现腐烂斑点作为腐烂判断的依据。按照腐烂面积将腐烂级别划分为4级：0级，无腐烂；1级，腐烂面积小于1/4；2级，腐烂面积占1/4～1/2；3级，腐烂面积大于1/2；统计每组24 个杨梅腐烂情况，每组3 个平行实验组，并按式（1）计算腐烂指数。

使用硬度计在杨梅赤道均匀间隔的两个点测定硬度，单位为N，每组3 个平行实验组，结果取平均值。

采用质量差法根据式（2）计算杨梅质量损失率。

式中：m0为样品的初始质量/g；mi为每次测定时样品的质量/g。

总可溶性固形物（total soluble solids，TSS）质量分数和可滴定酸（titratable acidity，TA）质量分数使用糖酸度一体机测定。TSS测定液通过均质器匀浆后过滤得到，取1 mL TSS测定液用50 mL去离子水稀释后获得TA测定液。

总酚、花青素和黄酮类化合物的含量按照曹建康等[24]的方法进行测定。

1.3.6 ASA含量的测定

ASA含量的测定参考文献[24]，以ASA为标准品构建标准曲线，得到回归方程：y＝0.004 2x+0.055 8，R2＝0.994 2，单位为mg/100 g。

1.3.7 丙二醛、H2O2与·含量的测定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用Wang Lei等[25]的方法进行测定，单位为nmol/g。

H2O2含量的测定参考文献[24]，以30%分析纯H2O2为标准品构建标准曲线，得到回归方程：y＝0.254 9x+0.017 6，R2＝0.999 3。

1.3.8 ROS代谢相关酶活力的测定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活力的测定参考文献[24]。以每分钟每克果蔬组织（鲜质量）的反应体系抑制氮蓝四唑（nitro blue tetrazolium,NBT）光还原50%为1 个SOD活力单位；以每克果蔬组织（鲜质量）每分钟吸光度增加1为1 个POD活力单位。

1.4 数据统计分析

实验数据采用Excel 2019软件进行整理，采用SPSS Statistics 26软件进行单因素方差分析，用Duncan多重比较法进行显着性差异分析，以P＜0.05为差异显着，采用Origin 2022b软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同处理方式对4 ℃下贮藏5 d杨梅品质指标的影响

在贮藏的第5天，MAP处理组中杨梅的腐烂指数均在11%以下，其中MAP 2组仅为2.08%，而对照组高达18.8%（表2）。MDA是膜脂氧化的中间产物，其含量是反映衰老的重要指标。气调处理均能减少MDA的积累，其中MAP 2组和MAP 3组包装内杨梅的MDA含量显着低于MAP 1组和对照组（P＜0.05）。这说明适宜比例的气调可以抑制腐烂的发生和膜脂氧化，延缓杨梅衰老和变质。

表2 不同MAP对4℃下贮藏5 d杨梅品质指标的影响Table 2 Effects of different MAP treatments on the quality of Chinese bayberry stored at 4℃ for 5 d

总酚、花青素和黄酮类化合物是植物体内的非酶类抗氧化物质，参与自由基的清除[27]。由表2可知，MAP 2组杨梅总酚、花青素和黄酮类化合物的含量显着高于其他处理组和对照组（P＜0.05），保持了较高的抗氧化活性。

OG处理组中非酶类抗氧化物质均维持在较高水平，且MDA含量均高于对照组（表3）。OG处理的杨梅有较低的腐烂指数，其中18.3 mg/m3的臭氧处理显着降低了杨梅的腐烂指数（P＜0.05）。

表3 不同浓度OG处理对4℃下贮藏5 d杨梅品质指标的影响Table 3 Effects of different OG concentrations on the quality of Chinese bayberry stored at 4℃ for 5 d

综上可知，MAP 2（10% O2+10% CO2+80% N2）和18.3 mg/m3分别是维持杨梅品质的最佳气体比例和臭氧浓度，因此以这两个参数结合微孔膜处理杨梅，以验证臭氧预处理协同P-MAP对杨梅在4 ℃下的保鲜效果。

2.2 不同微孔参数对包装内气体体积分数的影响

如图1所示，初始O2和CO2的体积分数均为10%。整个贮藏期间，MAP P0的O2体积分数不断下降，CO2体积分数不断上升，贮藏末期CO2体积分数已接近水果贮藏的发酵阈值20%[28]。而MAP P4中更多的穿孔增强了通过膜的气体交换[29]，导致包装内O2体积分数不断上升，CO2体积分数不断下降。MAP P2中CO2和O2在整个贮藏期间均处于9%～12%的体积分数区间，接近杨梅贮藏的最佳气体比例。综上可知，孔数为2、孔径为100 μm的微孔膜可以使杨梅包装内气体组成处于动态平衡，且与数学模型推导的孔参数（表1）趋于一致。

图1 不同孔数下杨梅在4℃贮藏7 d时MAP内O2（A）和CO2（B）体积分数的变化Fig.1 Evolution of O2 (A) and CO2 (B) concentrations in MAP with different numbers of perforations of bayberry during storage at 4℃ for up to 7 d

2.3 OG+MAP P2处理对杨梅腐烂指数的影响

与对照组相比，MAP P2和OG+MAP P2处理对杨梅有一定的保鲜效果，所有实验组在第1天均未腐烂，对照组和MAP P2组杨梅分别在第4天和第6天开始腐烂，并且随着时间的延长，腐烂现象不断加剧（图2）。OG+MAP P2处理组在第7天出现轻微腐烂，但在可接受的腐烂范围内。在整个贮藏期间，OG+MAP P2处理组杨梅的腐烂指数显着低于MAP P2处理组和对照组（P＜0.05），杨梅的无霉保质期被延长至8 d。

图2 OG＋MAP P2处理对杨梅在4℃贮藏期间腐烂指数的影响Fig.2 Effect of OG+MAP P2 treatment on decay index of Chinese bayberry stored at 4℃

2.4 OG+MAP P2处理对杨梅硬度及TSS、TA、ASA含量的影响

硬度是判断杨梅新鲜度的重要依据。在贮藏期间杨梅的硬度不断下降（图3A），这主要是由于在收获后杨梅仍会继续成熟，细胞壁多糖的降解会导致果实逐渐软化[30]。如图3A所示，两处理组均能延缓杨梅硬度的下降，在贮藏前期，OG+MAP P2处理组的杨梅硬度显着高于MAP P2组和对照组（P＜0.05），这与水果暴露在臭氧后细胞壁多糖的降解减缓有关[31]。Selma等[32]在对哈密瓜进行OG处理后也观察到了硬度下降减缓的现象。

图3 OG+MAP P2处理对杨梅在4℃贮藏期间硬度（A）及ASA（B）、TSS（C）、TA（D）水平的影响Fig.3 Effect of OG+MAP P2 treatment on firmness (A) and ASA (B),TSS (C) and TA (D) contents in Chinese bayberry stored at 4℃

ASA是水果营养价值的重要组成部分。杨梅ASA含量在整个贮藏期间呈持续下降的趋势（图3B），这是因为果实中含有促ASA氧化的酶，导致ASA不断氧化而含量下降[33]。对照组杨梅的ASA含量显着低于各处理组（P＜0.05），其中OG+MAP P2处理组杨梅的ASA含量最高，主要是由于臭氧可通过氧化分子产生应激，刺激天然植物防御机制，并通过增加细胞中的ASA等抗氧化化合物的合成和积累来维持ASA含量，且臭氧处理可抑制ASA氧化酶的活性[34]，因此OG+MAP P2处理组ASA含量下降的速度低于对照组，臭氧对ASA含量下降的抑制作用在树莓[35]贮藏保鲜中也已得到证实。

TSS和TA含量与水果风味密切相关，可指示水果成熟和衰老的程度[36]。随着贮藏时间的延长，所有包装内杨梅的TSS和TA质量分数都呈现相同的下降趋势（图3C、D），这是因为在贮藏过程中TSS和TA作为呼吸底物被不断消耗，以维持衰老过程中的正常呼吸[37]。处理组杨梅维持较高的糖酸度，其中OG+MAP P2处理组和MAP P2组的TSS和TA质量分数显着高于对照组（P＜0.05），贮藏末期OG+MAP P2处理组具有最高的TSS和TA质量分数。说明气调和臭氧处理均可抑制杨梅的呼吸，且两者协同处理抑制效果更显着，这可能是因为呼吸下降减少了TSS和TA的消耗，这与Chen Junran等[17]对青椒的研究结果一致。

2.5 OG+MAP P2处理对杨梅总酚、花青素和黄酮类化合物含量的影响

总酚、花青素和黄酮类化合物具有较强的抗氧化和自由基清除能力，其含量能够反映杨梅的抗氧化活性[20]。在贮藏期间，所有实验组杨梅的黄酮类化合物和总酚含量都显示出不同程度的下降趋势（图4A、C），两个处理组其含量的下降速率均减缓。这一缓慢下降趋势可归因于包装内低氧的环境保护了杨梅中酚类化合物免于被氧化，且气态臭氧可以作为酚类化合物生物合成的激发子[19]，从而增加总酚含量。OG+MAP P2处理组杨梅总酚和黄酮类化合物含量显着高于MAP P2组和对照组（P＜0.05）。说明臭氧协同MAP P2处理增强了对杨梅非酶类抗氧化物质的保护，Yeoh等[16]在对鲜切木瓜进行气态臭氧处理时也得到了类似的结果。

图4 OG＋MAP P2处理对杨梅在4℃贮藏期间总酚（A）、花青素（B）和黄酮类化合物（C）含量的影响Fig.4 Effect of OG+MAP P2 treatment on the contents of total phenols (A),anthocyanins (B) and flavonoids (C) in Chinese bayberry stored at 4℃

花青素是水果保持鲜艳、红色的主要成分。收获后，杨梅的色素继续合成，花青素含量在贮藏期间先上升后降低，且不同实验组的达峰时间不同。OG+MAP P2和MAP P2处理组中杨梅花青素含量不断上升，分别在第6天和第7天出现峰值后下降（图4B）。对照组杨梅花青素含量先略微上升，第4天后开始下降，在之后的整个贮藏期内均显着低于两处理组（P＜0.05）。Pinto等[20]对小浆果的研究发现，花青素的保存得益于MAP、低温和臭氧暴露诱导的非生物胁迫。因此，对照组包装内高氧环境和未经OG处理可能是花青素含量低于处理组的原因。此外，在处理组中观察到花青素含量急剧下降的现象，这是因为臭氧作为强氧化剂，在贮藏后期会导致花青素氧化降解，从而导致其含量减少。在其他研究中也观察到类似的结果，Chen Cunkun等[38]研究发现，臭氧处理的草莓花青素含量在21～28 d之间迅速下降，而对照组却基本保持不变。

2.6 OG+MAP P2处理对杨梅H2O2、·含量和POD、SOD活力的影响

H2O2和·是组织内ROS代谢失调的主要产物，其积累会导致果蔬的氧化损伤在成熟和老化过程中不断增强。整个贮藏期间，杨梅的H2O2和·含量整体均呈上升的趋势，OG+MAP P2处理组的H2O2含量在贮藏前5 d出现明显的下降趋势，这可能与OG+MAP P2处理诱导ROS代谢相关酶活性的上升有关[17]。各处理组杨梅的H2O2和·含量均显着低于同时间的对照组，其中OG+MAP P2处理组表现出更显着的ROS累积抑制（P＜0.05），在贮藏的第8天，对照组杨梅的H2O2和·含量比OG+MAP P2处理组分别高13%和22%。

POD是果蔬体内普遍存在且活性较高的氧化还原酶，与SOD等共同组成植物的酶促ROS清除系统[27]。各处理组杨梅P O D 活力在贮藏期间均先略微上升后下降，对照组P O D 活力的下降速度由快转慢（图5C）。POD活力越高，越容易从组织中清除H2O2。各处理组的杨梅POD活力在整个贮藏期间均显着高于对照组（P＜0.05）。贮藏8 d后，OG+MAP P2处理组的POD活力分别是MAP P2组和对照组的1.26 倍和1.42 倍，其对H2O2的清除能力增强。这是因为OG和MAP都可以增强酶促清除系统[15]，OG处理能快速诱导果实中POD活力的升高，但是随着贮藏时间的延长，POD活力会出现迅速降低的变化趋势。陈存坤等[39]也观察到OG处理的草莓POD活力具有先升高后下降的趋势，且处理组的POD活力显着高于对照组，这一结果也得到了Bortolin等[40]研究的佐证。

图5 OG＋MAP P2处理对杨梅在4℃贮藏期间H2O2（A）、·含量（B）和POD（C）、SOD（D）活力的影响Fig.5 Effect of OG+MAP P2 treatment on the contents of H2O2 (A)and superoxide anion (B) and the activities of POD (C) and SOD (D) in Chinese bayberry stored at 4℃

SOD活力在贮藏期间整体呈下降趋势，OG+MAP P2处理组在第4～6天略微上升（图5D），这与Sarkar等[41]发现OG可以诱导SOD基因表达的研究结果一致。各处理组中杨梅的SOD活力均高于对照组，其中OG+MAP P2处理组中SOD活力最高，第8天时是对照组的1.9 倍，提高了组织对·的清除能力[42]。Chen Junran等[17]也发现OG+MAP处理可以保持较高的SOD活性，延缓鲜切青椒的成熟和衰老进程。综上可知，OG+MAP P2处理提高了POD和SOD活力，进而减少了H2O2和·在组织内的积累（图5A、B），减轻了ROS对机体的损伤。

3 结论

采后保质期短是制约杨梅产业发展的瓶颈，本研究结果显示，微孔MAP和臭氧处理均能显着抑制杨梅采后腐烂的发生，并能维持其较高的抗氧化性能，且二者协同处理对杨梅表现出了更好的保鲜效果。这主要体现在OG+MAP P2处理减缓了杨梅硬度的下降，减少了TSS、TA和ASA的损失，维持了较高的总酚、花青素和黄酮类化合物等非酶类抗氧化物质的含量；此外，OG+MAP P2处理的杨梅的POD和SOD活力在第8天时分别是对照组的1.42 倍与1.9 倍，酶活力的提高增强了杨梅对ROS的清除能力，从而减少了H2O2和·的积累。OG+MAP P2处理将杨梅无霉保质期延长到8 d。因此，OG+MAP P2处理可以作为一种有效的复合保鲜技术应用于杨梅的采后贮藏，以防止杨梅的品质退化，延长其货架期。