李侨飞，张红印*，杨其亚，林 珍，程洋洋，孙艺文
（江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013）
防治水果病害的生防酵母及生防制剂研究进展
李侨飞，张红印*，杨其亚，林 珍，程洋洋，孙艺文
（江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013）
水果在生长和贮藏过程中极易受到病原菌侵染而腐烂，从而造成巨大的经济损失。目前，田间病害防控及采后果实贮藏保鲜主要依靠化学制剂。化学制剂因其高效性及便利性在农业领域备受欢迎，但化学制剂的广泛使用对人体和环境都造成了很大的危害。因此，水果防腐需要寻求更安全、环保并高效的方法，其中生物防治是替代化学防治的有效措施之一。本文主要探究了生防酵母对于水果采后病害的生防效果及存在问题，并对国内外生防制剂的研究现状和前景进行了分析讨论，以期能为我国酵母生防制剂的商业化生产与应用提供有价值的参考。
酵母；水果；采后病害；生物防治；生防制剂
我国是世界上最大的水果生产国，目前，我国果树种植面积1 320万 hm2，水果产量达12 660.82万 t。在2014年全国水果产量中，苹果、柑橘、梨、桃、葡萄的总产量为10 698.38万 t，占全国水果产量的79.18%[1]。虽然我国水果产量居世界之首，但水果采后腐烂造成的损失十分严重，我国每年由于病菌侵染和保鲜技术不完善所造成的果蔬损失占整个行业产值的30%以上。水果腐烂不是某一地域性的问题，而是在世界各国普遍存在的问题，联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）的报告表明，欧洲、北美和大洋洲等发达地区果蔬采后损失为29%；亚洲、非洲和拉丁美洲等地区果蔬采后损失为38%[2]。总体来说，即使在发达国家，每年由于采后病害造成的果蔬损失达到总量的20%～25%；在发展中国家，采后病害造成的果蔬损失更加严重[3]。造成水果腐烂的因素很多，其中水果采后由致病菌引起的腐烂造成的经济损失尤为严重，化学杀菌剂是目前运用最普遍和最有效的控制方法。为了保证和提高农作物的产量，农药和化学激素等农用化学制品的使用也越来越广泛。虽然保证了农作物的产量，但对土壤和水体等环境的污染却日趋严重，我国每年遭受农药残留污染的作物面积约达800万 hm2，其中污染严重的比例达40%[4]，并且施用于作物上的农药会在农作物里残留，不容易降解，对人体危害极大。而果蔬的农药残留问题更为严重，残留农药有机磷能引起神经功能紊乱，摄入后可能出现一系列神经毒性表现，严重者则会中毒死亡；重金属和硝酸盐污染属于慢性积累中毒，会引起癌症和精神分裂症等疾病[5]。因此化学制剂的使用不仅会引起农副产品质量下降，而且还会导致农业生态环境的恶化，对人们的生存健康带来巨大的安全隐患。所以为了保护食品的安全和生态环境，需要找寻可以代替化学杀菌剂的方法，生物防治是有效替代措施之一。加强生物防治的研究，提倡绿色发展已是当前农业经济发展的一项刻不容缓的任务。
1 拮抗酵母的生物防治效果及其存在的问题
水果采后的腐烂主要是由于真菌侵染所致，真菌是果实最主要的致腐病原菌。不同的水果主要的侵染菌也有所不同，葡萄的病害有灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）引起的灰霉病以及黑曲霉（Aspergillus niger）引起的黑粉病[6]。苹果采后贮藏期间腐烂的病害主要有扩展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病[7]；柑橘类采后腐烂的病害主要是由指状青霉（Penicillium digitatum）引起的绿霉病和意大利青霉（Penicillium italicum）引起的青霉病[8]。这些病害导致水果损失严重，对其的控制主要通过化学农药来实现；但近些年随着生物防治研究的加强，运用生物防治也可以有效地控制这些病害。利用生物防治来控制水果病害主要是利用生物物种间的相互关系，一种或一类生物抑制另一种或另一类生物的生长，从而达到抑制病菌、保鲜防腐的效果，对提高农作物的安全性及产量有着重要的推动作用。并且，生物防治和化学防治相比具有经济、有效、安全、污染小和产生抗药性慢等优点[9]。生物防治作为替代化学杀菌剂的环境友好、新型安全的方法，成为近年来学者研究的热点。目前已研究的可作为水果采后病害拮抗菌的微生物包括细菌、霉菌和酵母菌等。其中酵母菌因具有拮抗效果好、繁殖速度快、抗逆能力强、安全性高、遗传稳定、抑菌谱较广以及可以和化学杀菌剂共同使用等优点而成为水果采后生物防治研究的热点[10]。利用酵母菌进行水果采后病害生物防治，其拮抗机理主要表现为营养或空间竞争、对病原菌的寄生、抗生作用及诱导抗性等。国内外的科研工作者致力于研究拮抗酵母对水果病害的控制，均取得了非常好的研究成果。Wilson等[11]在20世纪90年代就开始研究水果采后病害，并致力于生物防治的研究，在生防酵母方面取得了不错的成果。随着对生防酵母的深入研究，世界各国的科研工作者在拮抗酵母生物防治方面取得了显着性的成果。浅白隐球酵母（Cryptococcus albidus）对梨果上感染的青霉病和灰霉病有很好的控制效果；膜璞毕赤酵母（Pichia membranifaciens）可以有效控制梨上的灰霉病[12]；卡利比克毕赤酵母（Pichia caribbica）可以有效控制桃子的根霉腐烂[13]；海洋红酵母（Rhodos poridium paludigenum）可以有效控制柑橘的绿霉病和青霉病[14]；异常毕赤酵母（Pichia anomala）SRF可以控制苹果的青霉病[15]；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可以有效控制葡萄的黑曲霉病[16]。Conceição等[17]研究发现，使用酵母LMA1结合Si处理组与对照组相比，细菌性果斑病的发病率明显降低，降低幅度可以达到80%以上[17]。Nally等[18]研究发现，在25 ℃、酵母浓度为107CFU/mL的条件下，与对照组相比，9 株酿酒酵母可以完全抑制葡萄上由灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）引起的灰霉病。LI Renping等[19]研究发现胶红酵母对于苹果灰霉病的控制效果显着，与对照组相比，胶红酵母处理组的灰霉病发病率降低了97.1%。近几年来我国科研团队也相继研究了多种酵母对果蔬病害的控制，取得显着效果。比如，葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）Y3可显着抑制柑橘的青霉病，实验组的腐烂率比对照组降低了61.8%，且结合15 mg/mL的卵磷脂使用，拮抗效果更好，比对照组的柑橘腐烂率降低了93.5%[20]。
酵母菌对水果采后霉菌病害的控制效果明显，但其缺点也同样存在。到目前为止，酵母菌的应用并不广泛，其商业化之路也十分艰难。究其原因主要有：1）研究酵母菌的时间较短、深度尚浅，文献报道的拮抗酵母大多用来防治采后水果伤口处的病原菌，而不是直接用在水果表皮防止正常水果的病原菌入侵[21]；2）在实际生产条件下，酵母菌受外界环境的影响较大，比如湿度、温度和酸碱度都会对酵母菌的活力造成很大的影响，酵母菌的活力一旦下降，就无法对病害起到应有的控制效果；3）目前使用拮抗酵母菌与化学杀菌剂相比成本较高，也没有化学杀菌剂的防治效果稳定；4）酵母菌不能长期在室温贮藏，使用期限短，并且不如化学试剂使用方便。这一系列的因素都影响了拮抗酵母菌的进一步开发与利用，阻碍了酵母菌作为水果保鲜剂和生防制剂在生产中的使用。
2 生防制剂的应用优势与国内外研究现状
要解决拮抗酵母作为水果生防菌剂在实际应用中存在的问题，就要提高拮抗菌的稳定性和生防效力，扩大拮抗酵母菌的应用范围。最新的研究结果显示，提高其生防效力的方法有以下几种：1）将拮抗菌与低剂量的化学杀菌剂混合使用防治病害，可提高拮抗菌的抑菌能力；2）使用生物工程技术改造拮抗酵母菌从而提高其生防效果，比如，Limón等[22]将chit33基因导入酵母Trichoderma harizanum后，其转化菌株产生的几丁质酶活力是野生型的200 倍以上，抑菌能力大大加强；但是利用转基因技术改造的菌株需要应用到实际生产中，必须经过后续的安全验证；3）将拮抗酵母研制成生防制剂，可以延长酵母菌的使用期限、提高酵母菌的生防效果。目前微生物制剂是研究的热点，因为生防制剂有许多优点：首先，其活性高、用量少，为一般化学农药用量的10%～20%；其次，生防制剂不会使病菌产生抗药性，并且分解快速，对人体和环境没有危害；最后，生防制剂所需的生产原料大多为农副产品，来源广、易生产，有比较好的经济效益[23]。生防制剂还可以结合化学物质从而制成复合生防制剂，进一步提高生防效果。比如拮抗酵母结合特定的化学物质如水杨酸、茉莉酸甲酯、碳酸氢钠、壳聚糖等可以大幅度提高其生防效力[24-27]。
随着科学技术的发展，越来越多的生防制剂产品实现了商业化，酵母制剂的优点突出，是当前研究的热点。但是除了酵母制剂，还有一些其他的生防制剂产品，也对水果病害有非常有效的控制效果。近年来已报道了多种实现商业化的生防制剂，如表1所示。早在1997年，新西兰的研究人员成功研制出一种具有商业化潜力并且对葡萄灰葡萄孢霉有较好控制力的生防制剂BOTRY-Zen。这种生防制剂可与其他真菌形成竞争抑制，杀死作物上经常出现的葡萄孢属（Botrytis）和核盘菌属（Sclerotinia）病害；而且，BOTRY-Zen孢子制剂不具有入侵性，不会对活的植物组织造成威胁。研究人员已经在新西兰葡萄园内对BOTRY-Zen进行了实验，结果显示只要正确使用，该产品可以有效保护葡萄不受灰葡萄孢霉感染。进一步的研究结果表明，6 g/L的商业制剂BOTRY-Zen可以有效地控制草莓和葡萄的果实腐烂率[28]。此外，研究人员发现BOTRY-Zen在黑醋栗和猕猴桃上也表现出了良好的真菌抑制效果[29]。Calvo-Garrido等[30]研究的结果也表明BOTRY-Zen的使用使葡萄灰霉病的发病率降低了50%左右，并且BOTRY-Zen还可以与克菌丹和硫磺等杀菌剂共同使用。另外，生防制剂Aspire也实现了商业化的应用，其起主要抑菌的活性成分为假丝酵母菌。食品公司研究了Aspire对柑橘类水果采后病害的防治效果，实验分为3 个组：对照组、实验组（Aspire结合200 μg/mL的噻苯咪唑）和农药组（2 000 μg/mL的噻苯咪唑、2 000 μg/mL的甲霜灵、2 000 μg/mL的抑霉唑和2 000 μg/mL的苯酚钠），3 个处理组的柑橘在20 ℃存放28 d。结果显示，对照组、实验组和农药组的柑橘腐烂率分别为24.2%、1.2%和2.2%[31]；说明Aspire可以有效控制柑橘的腐烂，对柑橘的绿霉病和青霉病有非常好的抑制效果。并且研究发现，Aspire还能控制由白地霉（Geotrichum candidum）引起的酸腐病[32]。Torres等[33]用海藻糖、丙三醇和聚乙二醇作假丝酵母液体制剂的保护剂，以此获得假丝酵母细胞的液体制剂，将其在4 ℃条件下保存4 个月后，假丝酵母的活力仍大于70%；进一步的实验表明假丝酵母制剂能有效地控制扩展青霉引起的金冠苹果腐烂，使其腐烂率降低55%。除了以上几种生防制剂，国外研发成功的商业生防制剂还有很多，并且在酵母制剂的商业化方面取得了显着的成果。生防制剂Candifruit的主要成分是假丝酵母菌（Candida sake），用于控制梨果和葡萄的病害，在西班牙地区已被广泛应用[34]。以梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）为主要成分研制的生防制剂Shemer在德国和荷兰被广泛应用，主要用于对多种蔬菜和水果的采前和采后灰霉病、青霉病等病害的控制[35]。生防制剂Nexy的主要成分是假丝酵母（Candida oleophila strain O），其于比利时被研制，因对果蔬病害有良好的控制效果而在欧洲国家普遍使用[36]。德国研究人员研究的一种酵母制剂，商品名为“Blossom-Protect”，在田间实验中展现了对苹果火疫病高效的控制效果[37]。
我国是农业大国，农作物丰富并且产量居于世界前列。近几年我国提倡绿色发展，同时也推动了生物防治的研究。但由于起步较晚且受技术方面的限制，我国生防制剂还没有实现广泛的商业化应用。在生防制剂商业化应用的道路上，我国的科研工作者在借鉴和自主研发中不断前行。徐占利[38]以胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）Y20为原材料，配合质量分数10%海藻糖、0.017 6% VC和磷酸盐缓冲溶液制备酵母制剂并以其处理梨，在20 ℃和4 ℃条件下保存30 d，结果显示酵母制剂对梨果的青霉菌以及灰葡萄孢霉有非常好的控制效果。温新宇[39]用0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）配制含有1×108CFU/mL Y35-1季也蒙毕赤酵母、质量分数5%海藻糖和0.01% VC的液体生防制剂和以海藻糖作为保护剂制备Y35-1季也蒙毕赤酵母活性冻干粉剂，研究这两种生防菌剂对枇杷贮藏保鲜方面的影响；结果显示：这2 种生防制剂能够明显抑制枇杷果实贮藏期间的病害腐烂发生率，在贮藏至第25天时，腐烂指数分别仅为3.89%和4.06%；并且这两种生防菌剂对枇杷的质量损失率、硬度、可溶性固形物含量、果皮细胞膜透性、VC含量、总糖含量、总酸含量、过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性方面均起到了一定的积极作用。表明这2 种生防菌剂对枇杷采后贮藏保鲜方面存在积极的影响。浙江大学、云南农业大学和云南省制药厂合作的高科技项目“木霉制剂的开发”，其结果显示，木霉制剂使百合和辣椒中根腐病的发病率降低了70%[40]。刘锦霞等[41]以枯草芽孢杆菌D17和Bs16（体积比为1∶1）共发酵物为主药制备的生防制剂在贮藏期间具有很高的稳定性，在小区实验中，枯草芽孢杆菌生防制剂的使用使得一品红植株的灰霉病发病率降低了85%以上。另有3 株枯草芽孢杆菌生防菌株MBI600、GB03、QST713获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可[42]。在自主研发的同时，我们还需要借鉴国外先进的生防制剂研究技术，推广优良的生防制剂产品。生防制剂EM是日本科学家在20世纪80年代初期研制出来的一种新型复合微生物菌剂，因其性能稳定、安全无害而备受关注，目前已在包括我国在内的160多个国家和地区推广应用。EM稀释液处理可使番茄花叶病发病率降低40%；用体积分数为0.1%的EM稀释液浸泡山渣，可起到保鲜作用[43]；EM使根霉菌引起的草莓根腐病的发病率降低了85%以上；以一定浓度的EM稀释液作追肥，还可以提高蔬菜和粮食作物产量，增产幅度在3.5%～15%[44]。
表1 商业化生防制剂所使用的主要微生物以及所控制的水果采后病害Table 1 Commercially available microbial biocontrol agents for the control of postharvest diseases of fruits
3 生防制剂目前面临的形势和应用前景
随着经济发展和生活水平的提高，人们对食品的安全和品质有了更高的要求，绿色无公害的食品越来越受到人们的追捧，运用生防制剂代替化学杀菌剂也是人心所向、大势所趋。目前已经有越来越多的化学杀菌剂被禁止应用在水果上。生防制剂则可以用来填补这些化学杀菌剂的空缺，从使用效果和发展形势来看，生防制剂显示出巨大的商业化应用前景。我国从2008年开始禁止使用久效磷、磷胺；百草枯水剂、毒死蜱、三唑磷等40多种化学农药自2016年底禁止在果蔬上使用。据研究报道，世界范围内的许多国家都在减少化学杀菌剂的使用量。2016年1～5月我国累计生产杀虫剂188 578 t，比2015年同期相比减少了9.6%[54]。根据德国农药工业协会的数据估计，与2008年相比，2009年全球农药市场销售下降9.6%[55]，欧洲农药市场销售额下降了2.9%。从农药类别看，除草剂的销售同比下降5.5%，杀菌剂销售同比下降1.9%[56]。并且，在全球统计的617 个农药统计品种中，已过专利期的品种约占70%～80%[57]。欧洲议会也通过一项决议，一旦条件成熟，将全面禁止在采后果蔬上使用化学杀菌剂。与此同时，生防制剂的使用量却在不断增加，Markets and Markets发布的《2012—2017全球生物农药市场趋势与预测》报告显示，2017年的生物农药制剂的销售额将会达到32亿 美元[58]。生防制剂的研究也并不仅仅是局限于微生物方面，其选材广阔，具有无限的开发性和可研究性。Wilson等[59]发现43 个科的多种植物提取物对B. cinerea病菌有拮抗作用，这些植物的提取物都表现出较强的抑菌活性。利用植物的提取物或者多种微生物来防治果实的采后病害也是全世界科学工作者研究热点，并且在欧美一些发达国家易被商业化运用。就目前形势综合来看，化学杀菌剂的使用量在不断减少，而生防制剂的使用量和应用范围都在不断增加，显示了生防制剂良好的发展形势。随着科学技术和时间的推进，生防制剂必将取代化学杀菌剂，存在着巨大的市场应用前景。
4 结 语
酵母菌作为优良的生防拮抗菌，对果蔬采后病害有显着的控制效果；它们来源广泛，能在比较干燥的水果表面生存，并且能够迅速利用营养物质进行繁殖。酵母生防制剂不仅可以解决酵母菌对采后水果病害防治的不足，还具有保鲜水果的作用，而且绿色环保、对人体健康无害。在已经实现商业化的生防制剂中，酵母生防制剂占了很大的比例，并且对病害的控制效果十分显着。但酵母生防制剂的商业化应用均在国外，国内尚未有酵母生防制剂商业化应用的成功案例，并且关于酵母生防制剂的相关研究报道较少，这说明在我国酵母制剂有非常大的研究空间和应用前景。
研究酵母生防制剂的技术要点在于要保证拮抗酵母的活性，尤其是在制备生防制剂的过程中，条件的变化会造成酵母大面积死亡。所以要优化制备条件，提高酵母的存活率；并且还要保证酵母对某些病菌或者某一病菌有较好的控制效果；最后还要确保酵母制剂有较长的货架期。虽然目前我国还没有实现酵母生防制剂的商业化应用，但国家在大力提倡绿色、生态、环保的发展道路时，对生物防治以及生防制剂方面的研究给予了越来越多了关注和支持，有大批的科研工作者投入到了生防领域。随着研究理论的不断深入，科学技术的日趋完善，相信在不久的将来，生防制剂必将实现商业化，给人类创造更安全的食品、更美好的环境。
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Progress in Biocontrol Yeast Agents for Preventing and Treating Diseases of Fruits
LI Qiaofei, ZHANG Hongyin*, YANG Qiya, LIN Zhen, CHENG Yangyang, SUN Yiwen
(College of Food Science and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)
Fruits are vulnerable to pathogen infection and consequently decay during growth and storage, which causes huge economic losses. At present, the prevention and control fruit diseases and postharvest preservation are primarily achieved by the use of synthetic fungicides. Chemical fungicides are commonly used to control diseases of fruits and vegetables because of their high eff i ciency and convenience. However, due to the development of resistance to fungicides in fungal pathogens,which causes harmful effects on the environment and human health, it is necessary to develop safer alternative methods without causing any adverse effects on the environment or human health. Biological control using biological control agents(BCAs) especially antagonistic yeasts has emerged as a very promising way to substitute synthetic fungicides to mitigate postharvest diseases of fruits. This review outlines the advantages and shortcomings of biocontrol yeasts in the prevention and control of postharvest diseases of fruits and discusses the current status and future prospects of biological control agents.We hope that this review will provide valuable information for commercial production and application of biocontrol agents.
yeast; fruit; postharvest diseases; biological control; biological agents
10.7506/spkx1002-6630-201801044
Q939.95
A
1002-6630（2018）01-0291-06
李侨飞, 张红印, 杨其亚, 等. 防治水果病害的生防酵母及生防制剂研究进展[J]. 食品科学, 2018, 39(1): 291-296.
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801044. http://www.spkx.net.cn
LI Qiaofei, ZHANG Hongyin, YANG Qiya, et al. Progress in biocontrol yeast agents for preventing and treating diseases of fruits[J]. Food Science, 2018, 39(1): 291-296. (in Chinese with English abstract)
10.7506/spkx1002-6630-201801044.http://www.spkx.net.cn
2016-10-21
国家自然科学基金面上项目（31271967）；江苏省农业科技自主创新资金项目（CX（15）1048）；
镇江市科技计划项目（农业科技支撑）（NY2013020）
李侨飞（1990—），男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：15862970889@163.com
*通信作者简介：张红印（1972—），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：zhanghongyin126@126.com
