何忠梅，李婷婷，赵玉娟，段翠翠，高 磊，牛春华，栾 畅，黄 城，李盛钰,*
肠道是人体最大的消化器官，完整的肠黏膜屏障能够阻止微生物及内毒素进入体循环，维持肠道正常功能，保证机体健康[1]。肠黏膜屏障功能一旦受损，肠道通透性升高，肠腔内内毒素突破肠道屏障进入机体循环，促使大量炎性细胞因子释放，引起机体炎症，进而诱发异常的黏膜免疫反应[2]。近年来研究发现肠黏膜屏障损伤与肠道炎症、机体免疫、肥胖、胰岛素抵抗及糖尿病等多种疾病相关[3-4]。因此，维持肠黏膜屏障功能的完整性将为临床疾病干预提供新思路。
益生菌是一类对宿主机体有益的微生物[5]。研究表明，益生菌能够减轻或阻止腹泻、肠易激综合征、炎症性肠病等疾病的发生[6-7]。它对肠道屏障的作用机制包括维持正常菌群结构；调节肠道微生态平衡；降低肠黏膜通透性；增加紧密连接蛋白的表达，修复机械屏障；抑制促炎因子分泌，保护肠道屏障。研究发现，益生菌可通过提高细胞间紧密连接蛋白分泌，修复侵袭性大肠杆菌引起的肠黏膜损伤[8]。Mennigen等[9]对小鼠诱导结肠炎的同时补充益生菌VSL＃3，结果表明小鼠炎症反应减轻，肠道通透性及紧密连接蛋白表达水平均得到改善。益生菌还可抑制细胞因子介导的信号转导通路，减少TNF-α、IL-6等炎症因子的产生，增加上皮紧密连接蛋白分泌并促进损伤上皮细胞修复，加强肠黏膜屏障的保护作用[10]。
植物乳杆菌Sc52菌株是从东北发酵酸菜中分离鉴定的一株乳酸菌菌株。课题组前期研究发现，植物乳杆菌Sc52具有辅助降血糖功效。该菌株通过调节脂类代谢、降低炎症水平、促进肠道有益菌生长等途径降低高脂饲料和STZ诱导糖尿病模型小鼠的血糖，同时上调IRS-2、GCK、GLUT2等相关蛋白的表达，恢复胰岛素的敏感性，有效调节血糖代谢[11]。为了进一步探讨植物乳杆菌Sc52降血糖的作用机制，本研究分析了植物乳杆菌Sc52对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导小鼠肠道屏障损伤的保护作用，为菌株的应用开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 动物、材料与试剂
清洁级ICR雄性小鼠（体质量18～22 g），购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，基础饲料适应性喂养1 周。
菌株Sc52分离自中国东北传统发酵酸菜，菌株经表型、APICHL生化分析及16S rDNA序列分析鉴定为乳酸菌属植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。2015年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：11027。菌株在添加20%（体积分数）甘油的MRS（deMan Rogosa and Sharpe）培养基中冻存（-80 ℃）。使用前菌株按体积分数3%接种量接种于MRS液体培养基，连续活化3 代。活化后的菌株接种于MRS液体培养基，37 ℃静置培养16 h，4 ℃、6 000 r/min离心10 min，去上清液。菌体用无菌生理盐水洗涤离心后，配成菌悬液，根据OD600nm检测和平皿计数结果，调整菌液浓度为1×1010CFU/mL，备用。
MRS基础培养基、LBS（Lactobacillus selection）琼脂培养基、双歧杆菌琼脂（MRS、萘啶酸、硫酸新霉素、氯化锂和硫酸巴龙霉素）培养基、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（tryptose sulfite cycloserine agar base，TSC）培养基、肠道菌计数琼脂（violet red bile dextrose agar，VRBDA）培养基、胆盐-七叶苷-叠氮钠琼脂（bile esculin azide agar，BEA）培养基 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
大肠杆菌脂多糖055:B5 美国Sigma公司；乙酸、丙酸、丁酸标准品（均为色谱纯） 上海晶纯生化科技股份有限公司；小鼠血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-12、D-乳酸（D-lactic acid，D-Lac）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒上海朗顿生物技术公司；RIPA蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒 北京鼎国昌盛生物技术有限公司；GAPDH抗体、兔抗ZO-1单克隆抗体、兔抗Occludin单克隆抗体、兔抗Claudin-1单克隆抗体 英国Abcam公司；山羊抗兔二抗 北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
Sorvall Evolotion RC高速冷冻离心机 美国Thermo公司；HZQ-Q电热恒温培养箱 上海一恒实验设备有限公司；Cary300紫外-可见分光光度计 美国Varian公司；ELx800全自动酶标仪 美国BioTek公司；BX50光学显微镜 日本Olympus公司；电泳和转印系统美国Bio-Rad公司；ChemiScope 5600化学发光成像系统上海勤翔科学仪器有限公司；GC 7890A型气相色谱仪美国Agilent技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 实验动物及分组处理
小鼠随机分为3 组，每组21 只。Sc52组灌胃植物乳杆菌Sc52 1010CFU/d，空白组和模型组小鼠灌胃等量生理盐水，连续14 d。末次灌胃12 h后，模型组与Sc52组一次性腹腔注射15 mg/kg LPS，空白组注射等量生理盐水。各组小鼠经眼球取血，4 ℃、2 800 r/min离心10 min，收集上清液，-80 ℃冻存，待用。小鼠取血后经脱颈处死，取肝脏、脾脏、肾脏称质量。收集回肠组织，预冷生理盐水冲洗，部分用于苏木精-伊红（hematoxylin-eosin）染色，部分迅速放入-80 ℃冰箱冻存，用于Western blot分析。
1.3.2 一般体征观察与小鼠脏器指数的测定
实验期间每日称量小鼠体质量，观察小鼠的精神、运动和呼吸等状况。小鼠腹腔注射LPS后，观察小鼠精神状态、腹泻及死亡状况。各组小鼠肝脏、脾脏、肾脏称质量，各脏器质量与小鼠终体质量的比值即为脏器指数。
1.3.3 血清生化指标测定
按照ELISA试剂盒说明书，检测小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-12、NO、DAO与D-Lac水平。1.3.4 小鼠回肠组织病理学检测
小鼠回肠组织（距小肠回盲部1 cm处）1 cm，经体积分数4%甲醛溶液固定，不同体积分数梯度乙醇处理后固定于石蜡中，切片后进行HE染色，光学显微镜下观察小鼠回肠组织病理学变化。
1.3.5 小鼠肠道短链脂肪酸质量浓度的测定
取小鼠结肠内容物0.1 g，加蒸馏水5 mL溶解并振荡2 h，12 000 r/min离心10 min。取上清液2 mL采用0.45 μm滤膜过滤，依次加入质量分数为50%的H2SO40.4 mL，乙醚2.0 mL，振荡30 次后12 000 r/min离心5 min，置于4 ℃冰箱中30 min，取上层乙醚溶液进行气相分析[12]。测定采用外标法，用乙酸、丙酸和丁酸作标准曲线。气相色谱测定条件：DB-FFAP色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。升温程序：初温120 ℃，维持5 min，以15 ℃/min升温到250 ℃，保持1 min。FID温度：280 ℃；载气：氮气；分流比：10∶1；流速：2.0 mL/min；待测样品进样体积：2 μL[13]。
1.3.6 小鼠肠道菌群计数
分别于第0、7、14天（注射LPS 6 h后），每组取3 只小鼠，无菌条件下取小鼠成形肠内容物于试管内，无菌生理盐水梯度稀释，分别涂布于LBS、双歧杆菌琼脂培养基、VRBDA、BEA和TSC琼脂平板，每个稀释度做3 个平行，37 ℃厌氧或需氧培养24～48 h，检测乳杆菌、双歧杆菌、肠杆菌、肠球菌和产气荚膜梭菌数量。以显微镜镜检、革兰氏染色鉴定目标菌落，并进行菌落计数。
1.3.7 Western blot检测回肠组织紧密连接蛋白表达
取-80 ℃冰箱中冻存的小鼠回肠组织，参照蛋白抽提试剂盒说明书提取蛋白，Western blot法检测小鼠回肠组织中ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白的表达。
1.4 数据统计分析
实验数据处理采用SPSS 21.0统计分析，结果以 ±s表示，各实验组间数据采用方差比较分析。以P值表示统计学差异，P＜0.05为差异显着，P＜0.01为差异极显着。
2 结果与分析
2.1 小鼠一般体征观察与脏器指数
表1 植物乳杆菌Sc52对小鼠脏器指数的影响Table 1 Effect of L. plantarum Sc52 on organ indexes of mice
由表1可知，灌胃植物乳杆菌Sc52期间小鼠生长和精神状况良好，摄食、饮水、呼吸和排泄等方面正常。LPS诱导后，模型组小鼠30 min后开始出现立毛、发抖、呼吸急促的现象。2 h后小鼠精神萎靡，活动能力减弱，伴有腹泻等症状；而Sc52组小鼠精神状态、活动能力与对照组相比差异明显，但腹泻症状较模型组减轻。至实验结束（第14天），无小鼠死亡。如表1所示，模型组小鼠经LPS诱导后，肝脏、脾脏、肾脏的脏器指数均有不同程度的增加，与空白组相比差异显着，而灌胃植物乳杆菌Sc52的小鼠肝脏、脾脏、肾脏的脏器指数均低于模型组。
2.2 植物乳杆菌Sc52对小鼠血清中炎症因子水平的影响
表2 植物乳杆菌Sc52对小鼠血清中炎症因子的影响Table 2 Effect of L. plantarum Sc52 on serum inflammatory cytokines in mice
由表2可知，LPS诱导小鼠肠屏障损伤后，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-12、NO水平明显升高，与
空白组相比差异极显着（P＜0.01），由于内毒素进入血液循环后激发机体的炎症反应，使机体炎症水平迅速升高，而灌胃植物乳杆菌Sc52菌液后的小鼠炎症反应减轻，小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-12水平和NO水平均呈不同程度降低。提示植物乳杆菌Sc52能明显缓解LPS诱导的小鼠炎症反应，降低小鼠血清中炎症因子水平。
2.3 植物乳杆菌Sc52对小鼠血清中D-Lac和DAO水平的影响
图1 植物乳杆菌Sc52对小鼠血清中D-Lac的影响Fig. 1 Effect of L. plantarum Sc52 on serum D-Lac in mice
图2 植物乳杆菌Sc52对小鼠血清中DAO的影响Fig. 2 Effect of L. plantarum Sc52 on serum DAO in mice
由图1、2可知，注射LPS 6 h后，小鼠血清中D-Lac和DAO水平迅速升高。模型组D-Lac与DAO水平分别升高到3.65 μmol/mL、74.36 ng/mL，而灌胃植物乳杆菌Sc52的小鼠血清中D-Lac与DAO水平分别为3.23 μmol/mL、62.82 ng/mL，与模型组相比差异性极显着（P＜0.01）。表明LPS诱导后小鼠肠屏障受损，肠道通透性增加，导致通透性相关的指标水平迅速升高。提示植物乳杆菌Sc52通过改善肠道通透性水平，缓解LPS对肠道屏障造成的损伤。
2.4 植物乳杆菌Sc52对小鼠回肠病理学的影响
图3 植物乳杆菌Sc52对小鼠回肠组织病理学变化的影响（1 000×）Fig. 3 Effect of L. plantarum Sc52 on histopathological changes in the ileum of mice (1 000 ×)
由图3可知，空白组小鼠的回肠绒毛结构完整，上皮细胞排列整齐，无明显的炎性细胞浸润及肠黏膜上皮细胞脱落现象（图3A）；模型组小鼠的回肠上皮细胞排列紊乱，肠黏膜绒毛出现破损，炎细胞浸润出现血灶，这是由于LPS的破坏作用所引起（图3B）；灌胃植物乳杆菌Sc52的小鼠回肠上皮细胞排列未见明显异常，肠组织中偶见炎性细胞浸润伴有充血，但与模型组相比，症状明显减轻（图3C）。提示植物乳杆菌Sc52能够减轻LPS对回肠黏膜组织所造成的损伤。
2.5 植物乳杆菌Sc52对小鼠肠道短链脂肪酸的影响
表3 植物乳杆菌Sc52对小鼠肠道短链脂肪酸质量浓度的影响Fig. 3 Effect of L. plantarumSc52 on intestinal short-chain fatty acids in mice mg/mL
如表3所示，模型组小鼠肠道中短链脂肪酸总量明显下降，表明模型组小鼠肠道平衡被破坏，预先灌服植物乳杆菌Sc52菌液的小鼠肠道中短链脂肪酸总量升高，为2.39 mg/mL，其中乙酸质量浓度1.86 mg/mL，丁酸质量浓度0.32 mg/mL，与模型组相比具有显着差异（P＜0.05）。以上结果表明，植物乳杆菌Sc52能够升高小鼠肠道中短链脂肪酸水平。
2.6 植物乳杆菌Sc52对小鼠肠道菌群的影响
表4 植物乳杆菌Sc52对小鼠肠道菌群的影响Fig. 4 Effect of L. plantarum Sc52 on the intestinal microflora in mice lg（CFU/g）
由表4可知，灌服植物乳杆菌Sc52菌液至第7天时，小鼠肠道中乳杆菌、双歧杆菌的数量增加，肠杆菌数量降低，与模型组相比，具有显着性差异（P＜0.05）。随着灌胃时间的延长，第14天，LPS的破坏作用致使肠道菌群失调，模型组小鼠肠道中乳杆菌与双歧杆菌数量有所减少，肠杆菌、肠球菌及产气荚膜梭菌数量均有不同程度增多，而灌服植物乳杆菌Sc52菌液的小鼠肠道中乳杆菌与双歧杆菌数量高于模型组，肠杆菌数量低于模型组，差异性极显着（P＜0.01），肠球菌和产气荚膜梭菌数量均低于模型组，差异显着（P＜0.05）。表明植物乳杆菌Sc52能够促进肠道中有益菌的生长，抑制有害菌的繁殖，调节机体肠道微生态平衡，改善LPS引起的小鼠肠道菌群失调，保护肠黏膜生物屏障。
2.7 植物乳杆菌Sc52对小鼠回肠紧密连接蛋白表达的影响
小鼠回肠上皮细胞间紧密连接蛋白表达如图4所示，LPS能够直接作用于肠上皮细胞，破坏紧密连接蛋白结构，降低紧密连接蛋白ZO-1、Occludin与Claudin-1的表达。与模型组相比，植物乳杆菌Sc52预防组小鼠回肠Occludin与Claudin-1蛋白的表达量分别增加了83.78%、143.24%，差异呈极显着性（P＜0.01），Sc52组小鼠回肠ZO-1蛋白表达量增加了33.33%，表明植物乳杆菌Sc52能够通过上调肠上皮细胞间紧密连接蛋白表达量，对LPS引起的肠道屏障损伤发挥保护作用。
3 讨 论
炎症反应是决定肠道屏障功能损伤及其相关疾病发展的关键因素，脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，进入机体循环后作用于细胞膜受体，激活细胞内信号转导系统，启动宿主防御反应，释放多种炎性因子诱发全身性炎症反应，损伤肠黏膜屏障[14]。有文献报道，外源性摄入益生菌能够减轻机体炎症反应，主要通过调节多条信号转导通路，抑制多种促炎细胞因子产生从而降低促炎细胞因子对肠黏膜屏障完整性的破坏[15-16]。本研究中，与空白组相比，小鼠注射LPS 30 min后，开始出现倦怠少动，呼吸加快，并伴有腹泻症状。模型组小鼠脏器指数及血清中TNF-α、IL-6、IL-12、NO等炎症因子表达显着升高，而预先灌胃植物乳杆菌Sc52的小鼠脏器指数及血清中炎症因子含量与模型组相比显着降低，提示植物乳杆菌Sc52能够抑制多种炎症因子产生。这与Chen等[17]的报道相一致，益生菌可通过抑制TNF-α、IL-6等炎性细胞因子分泌，调节肠黏膜免疫功能，保护肠道屏障。
越来越多的证据表明，肠黏膜屏障的完整性对肠道正常功能的维持具有非常重要的作用[18]。肠黏膜屏障一旦受损，肠道通透性发生改变，检测血清中D-Lac水平变化能够及时反映肠黏膜通透性的变化和损害程度[19]。DAO大部分存在于小肠黏膜绒毛，因其在外周血中活性稳定，故检测血中DAO水平高低，能够反应肠黏膜损伤与修复程度[20]。观察小鼠回肠病理切片可知，由于LPS的破坏作用，模型组小鼠回肠黏膜严重受损，而预先灌服植物乳杆菌Sc52菌液的小鼠与模型组相比损伤程度较轻。注射LPS 6 h后，模型组小鼠血清中D-Lac与DAO水平明显升高，而预先灌胃植物乳杆菌Sc52能够降低小鼠血清中D-Lac与DAO水平，提示植物乳杆菌Sc52可抑制由LPS引起的小鼠肠道通透性升高。研究发现，血清D-Lac水平升高，肠道通透性增加，回肠黏膜组织紧密连接蛋白水平显着降低，表明肠道通透性的改变与肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达密切相关[21]。肠上皮细胞间紧密连接蛋白对维持肠黏膜上皮细胞屏障功能、调节肠道通透性及维持细胞骨架完整性具有重要作用，其中Claudin-1、Occludin、ZO-1是反映紧密连接蛋白完整性的敏感性指标[22]。本研究发现，注射LPS后，模型组小鼠回肠组织Occludin、Claudin-1和ZO-1的表达量减少，该结果与Anderson等[23]的研究结果一致，据报道，LPS可直接作用于肠黏膜，破坏紧密连接蛋白磷酸化与去磷酸化过程，损害肠黏膜屏障功能，增加肠黏膜通透性，削弱屏障作用[24-25]。既往多项研究表明多种益生菌可通过调节紧密连接蛋白表达改善肠道的通透性，体外研究表明，益生菌VSL＃3通过调节紧密连接蛋白表达水平，能够修复TNF-α引起的HT-29单层细胞损伤[26]。体内研究发现，经EcN饲喂后的小鼠回肠组织ZO-1的mRNA和蛋白的表达量都有不同程度的增加，肠上皮屏障功能并得以改善和修复[27]。本研究结果也同样表明，灌胃植物乳杆菌Sc52的小鼠回肠组织Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表达水平均有不同程度的增加，推测其作用机制可能是通过上调肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达，降低血清中炎症因子和D-Lac及DAO水平，减轻肠上皮的损伤，降低肠道通透性，保护肠黏膜上皮间的紧密连接结构，改善肠黏膜屏障功能，从而达到抗炎作用并维持屏障功能完整性。
肠道菌群组成的微生态系统作为生物屏障抵御病原体的入侵，保证机体健康。摄入外源性的益生菌可通过消耗肠道内氧气调节肠道有益菌与有害菌的数量，维持机体肠道菌群平衡，并对失调的肠道菌群具有修复作用[28]。研究发现，对正常小白鼠给予双歧杆菌菌液灌胃，与对照组相比，实验组双歧杆菌数量显着增加，肠杆菌数量显着下降[29]。用双歧杆菌BBMN01菌液给予小鼠连续灌胃14 d后，小鼠肠道中乳杆菌与双歧杆菌数量显着增多，肠杆菌数量显着降低。表明双歧杆菌的摄入对机体肠道菌群具有一定的调节作用[30]。本研究中，植物乳杆菌Sc52能够显着提高小鼠肠道中乳杆菌、双歧杆菌两种主要益生菌数量，显着降低肠杆菌与产气荚膜梭菌数量。其机理为植物乳杆菌Sc52在肠道繁殖，消耗大量氧气，肠道内氧浓度降低，改善了双歧杆菌等厌氧菌的生长环境，同时也使肠道中肠杆菌和肠球菌等需氧菌的生长因缺氧而受到抑制。提示植物乳杆菌Sc52具有增加肠道有益菌数量、降低有害菌数量，调节肠道微生态平衡，改善肠黏膜生物屏障损伤的作用。
综上所述，植物乳杆菌Sc52可通过降低机体血清中炎症因子水平、改善肠黏膜通透性、调节肠道微生物平衡、上调肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达，维持肠道屏障结构和功能的完整性。
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