高志玲，陈 艳，谢英辉
黄花蒿挥发油的体外抑菌活性研究
高志玲，陈 艳，谢英辉
(白城医学高等专科学校，吉林 白城 137000)
采用水蒸气蒸馏法提取黄花蒿挥发油，通过体外抑菌实验，利用纸片法和试管法分别测定其抑菌活性和最低抑菌浓度(MIC)。比较黄花蒿挥发油对12种常见细菌和真菌的抑菌活性。结果表明：黄花蒿挥发油对12种实验菌表现出不同的抑制活性。真菌对黄花蒿挥发油具有更强的敏感性。黄花蒿挥发油对真菌的抑制作用比较稳定，由强到弱依次为黑曲霉、啤酒酵母菌、产黄青霉、马青霉、毛霉、青霉和根霉。
黄花蒿；挥发油；真菌；细菌；最低抑菌浓度
黄花蒿(Artemisia annua L.)菊科蒿属(Artemisia)，为一年生草本植物，在全国各省份均有分布，是一种传统中草药，其地上部分常称为青蒿。据我国药典上记载，青蒿性苦、辛、寒；归肝、胆经。具有清热解暑，除蒸，截疟的功效[1]。黄花蒿的主要有效成分为青蒿素和挥发油等。现代药理研究表明，黄花蒿具有抗疟[2-3]、抗病毒[4]、杀螨虫[5]、解热抗炎[6]、抗氧化[7]和提高免疫力等多种功效[8]。研究证实，对黄花蒿采用不同的提取方法和各种有机溶剂进行提取，提取物对多种细菌，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单核增多性李氏杆菌和白色念珠菌等均有不同程度的抑菌作用[9-10]。另有一些研究结果显示黄花蒿的有机溶剂提取物对许多植物性病原真菌具有显着的抑制作用[11-14]。本实验以水蒸气蒸馏法，提取黄花蒿挥发油，研究其对几种常见细菌和真菌的抑制作用，测定最低抑菌浓度，以期为黄花蒿的综合利用和天然食品防腐剂的开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
野生黄花蒿采自吉林省白城市近郊，经东北师范大学生命科学学院肖洪兴教授鉴定为菊科植物(Artemisia annua L.)。
1.2 供试菌种
细菌：变形杆菌(Proteusbacillus vulgaris)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、四联球菌(Micrococcus tetragenus)、产气杆菌(Clostridium perfringens)和粪便链球菌(Fecal streptococcus)；真菌：根霉(Rhizopus spl.)、青霉(Penicillium sp.)、毛霉(Mucor racemosus)、马青霉(Penicillium marneffei)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、黑曲霉(Aspergillus niger)和啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，均由东北师范大学生命科学学院微生物实验室提供。
1.3 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基(细菌用)；沙保培养基(真菌用)，121℃高压灭菌20min，备用。
1.4 仪器与设备
挥发油提取器 上海亚荣生化仪器厂；YXQ.SG41.280型手提式压力蒸汽灭菌器 上海医疗器械工业公司江阴医疗设备厂；电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械一厂；AY220电子天平 日本岛津公司。
1.5 方法
1.5.1 黄花蒿挥发油的制备
取黄花蒿全草的鲜品，水蒸气蒸馏法提取得到淡黄色油脂，即为黄花蒿挥发油。黄花蒿挥发油用吐温-80乳化，再溶解于一定体积的水中，配制成6.25～50.0mg/mL不同质量浓度的溶液，于冰箱中4℃保存备用。
1.5.2 纸片法测定抑菌效果
用打孔器将干净的滤纸制成直径为0.5cm的小圆纸片，干热灭菌后，分别浸入不同质量浓度的溶液中，使其充分吸收，备用。在超净台里将转接后生长良好的菌种试管斜面注入适量无菌水，制成菌悬液，注入平板，涂布均匀。将浸泡处理过的滤纸片沥干，贴在上述含菌平板上，每个平板贴3片相同黄花蒿挥发油质量浓度的滤纸片。吐温-80和无菌水的混合液作为空白对照，重复实验2次。置于培养箱中，细菌37℃培养24h，真菌28℃培养48h。取出量取抑菌圈直径，测量实验结果，取平均值。
1.5.3 试管法测定最低抑菌浓度(MIC)
根据滤纸片法所得的结果，参照文献[15]，采用试管法对各受试菌种进行最低抑菌浓度测定(MIC)。 培养基以每管总体积5mL分装于试管中，121℃、0.1MPa条件下灭菌20min。当灭菌培养基冷却至50℃左右时，加入黄花蒿挥发油，倍比稀释成0.3125～20.0mg/mL梯度质量浓度，充分混匀，无菌水作对照，分别制成斜面。取生长良好的受试菌划线接种于斜面上。细菌放于37℃ 温箱中培养，观察24h菌落生长状态。真菌放于28℃温箱中培养，观察48h菌落生长状态。取完全不生长管样品最低质量浓度为最低抑菌浓度(MIC)。
2 结果与分析
2.1 不同质量浓度黄花蒿挥发油抑菌效果
用吐温-80和无菌水配制50.0、25.0、12.5、6.25、3.125mg/mL的挥发油溶液，采用滤纸片扩散法测定抑菌圈直径。结果见表1。
由表1可知，黄花蒿挥发油对供试的5种细菌、7种真菌都有较强的抑菌活性。供试菌种中，既有细菌又有真菌，而且黄花蒿挥发油对革兰氏阳性和阴性菌均有不同的抑制作用。与细菌比较，真菌对黄花蒿挥发油较为敏感。因此，黄花蒿挥发油具有广泛的抑菌作用。
表1 黄花蒿挥发油的抑菌活性(抑菌圈直径)测定结果Table 1 Inhibition zone diameters of the essential oil from Artemisia annua against 12 test strainsmm
2.2 最低抑菌浓度(MIC)的测定
用培养基配制20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL的黄花蒿挥发油溶液，采用试管法测定样品MIC，取完全不生长管样品最小质量浓度作为最低抑菌浓度，结果见表2。
表2 黄花蒿挥发油最低抑菌浓度(MIC) Table 2 MICs of the essential oil from Artemisia annua against 12 test strains
由表2可以看出，黄花蒿挥发油对真菌的抑制效果显着高于细菌，黄花蒿挥发油对真菌的MIC＜2.5mg/mL，而对细菌的MIC＜10mg/mL，此结果与滤纸片法结果相一致。
3 讨 论
通过本实验结果可以看出，随着质量浓度的增大，黄花蒿挥发油对供试菌种的抑菌效果均呈上升趋势。黄花蒿挥发油对受试菌种都有很强的抑菌作用，对真菌生长的抑制作用要显着强于对细菌生长的抑制作用。在真菌中，黄花蒿挥发油对黑曲霉的生长抑制最强，在50.0mg/mL时，抑菌圈是17.2mm，对啤酒酵母菌和产黄青霉的生长也有明显抑制作用，在50.0mg/mL时，抑菌圈直径分别为15.8mm和15.0mm；对青霉和毛霉的抑制作用稍弱，抑菌圈分别为12.8mm和11.8mm。抑菌效果顺序为：黑曲霉＞啤酒酵母菌＞产黄青霉＞马青霉＞毛霉＞青霉＞根霉。黄花蒿挥发油对真菌的MIC为1.25～2.5mg/mL。
黄花蒿挥发油对细菌的抑制作用相对较弱，在50.0mg/mL时，粪便链球菌和四联球菌的抑菌圈分别为9.8mm，变形杆菌生长受黄花蒿挥发油的影响不显着，在50.0mg/mL时有抑菌圈，为7.2mm。抑菌效果顺序为：粪便链球菌＞四联球菌＞产气杆菌＞枯草杆菌＞变形杆菌。黄花蒿挥发油对真菌的MIC大多为5mg/mL，而变形杆菌对黄花蒿挥发油的敏感性较弱，MIC为10mg/mL。
黄花蒿挥发油对受试菌种的抑菌作用基本一致，对真菌作用抑制较强，对细菌的抑菌活性相对较差。已有研究证实，黄花蒿挥发油中萜类和半萜类化合物含量高达90%以上[16-19]，萜类化合物在生活中常被用作食品、医药、农药和食品添加剂、动物添加剂等，由于其功能特殊、用途广泛，开发前景十分广阔，在国际上已逐渐成为研究热点。而且，黄花蒿挥发油的抑菌作用并非单一化合物的活性，可能是多种成分的协同作用。为了进一步了解黄花蒿挥发油活性物质的抑菌机理，可对提取物进行分离纯化，深入探讨其活性物质的抑菌机理及其构效关系。黄花蒿在我国资源丰富、产量高，其挥发油对细菌、真菌具有较好的抑制作用，作为中药资源有必要对其进行更深入的抑菌活性实验，为天然抗菌药物和食品防腐剂的开发提供理论依据。
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in vitro Antimicrobial Activity of Essential Oil from Artemisia annua
GAO Zhi-ling，CHEN Yan，XIE Ying-hui
(Baicheng Medical College, Baicheng 137000, China)
The essential oil extracted from Artemisia annua by steam distillation was determined for its in vitro antibacterial activity (inhibition zone diameter) by disk diffusion method and minimum inhibitory concentration (MIC) by test tube method. Twelve species of common bacteria or fungi were the indicator strains used. The essential oil had different inhibitory effects on these test strains. Comparatively, fungi were more sensitive to the oil, and its anti-fungus activity was stable, and it had the strongest inhibitory effect on Aspergillus niger, followed by Saccharomyces cerevisiae, Penicillium chrysogenum, Penicillium marneffei, Mucor racemosus, Penicillium sp. and Rhizopus sp. Thus, the essential oil has broad application prospects for the development of a natural preservative or an antimicrobial drug.
Artemisia annua；essential oil；fungi；bacteria；minimum inhibitory concentration
Q936
A
1002-6630(2010)19-0209-03
2010-05-10
高志玲(1971—)，女，讲师，硕士，主要从事病原生物学和免疫学。E-mail：gaozl3669@163.com
