胡洁云，欧 杰,*，李柏林，严维凌，林 露
气调包装冷却牛肉特定腐败菌生长模型的建立
胡洁云1，欧 杰1,*，李柏林1，严维凌2，林 露2
(1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海市食品研究所，上海 200235)
以气调包装冷却牛肉为研究对象，研究储藏在0、5、10℃温度条件下气调包装冷却牛肉中特定腐败菌(假单胞菌)的生长变化规律。通过Matlab7.0软件拟合不同温度条件下假单胞菌的生长情况，得到假单胞菌生长的Gompertz模型参数；利用响应面方程建立假单胞菌生长的二级模型；由平方根方程建立了温度对假单胞菌生长动力学影响的数学模型。进而验证0～10℃低温条件下假单胞菌的生长动力学模型。结果表明：建立的Gompertz方程拟合相关系数均在0.99以上，二级模型偏差度和准确度均在0.90～1.05之间，说明建立的一级和二级模型能够真实有效地预测0～10℃条件下气调包装冷却牛肉中假单胞菌的生长情况。
冷却牛肉；气调包装；预测模型；特定腐败菌；假单胞菌
对冷却肉中腐败微生物的研究结果表明，在大多数情况下，冷却肉表面所含微生物中只有部分微生物参与腐败过程[1]，这些适合生存和繁殖并产生腐败臭味和异味代谢产物的主要腐败微生物，就是该产品的特定腐败菌(specific spoilage organisms，SSO)[2]。李正堂等[3]报道冷却牛肉中假单胞菌属为特定腐败菌。
为了确保冷却肉质量在销售过程中的安全与稳定，如何延长货架期，控制冷却肉中特定腐败菌的生长是关键之一。近年来微生物预报技术在国外被广泛研究，利用数学模型定量描述食品特性(如pH值、水分活度)和加工流通环境因子(如温度、氛围气体)对食品中微生物生长、残存、死亡动态的影响，用来预测食品的货架期和微生物学安全[4]。Mckellar等[5]提到很多研究微生物生长模型的方法，其中依据修正Gompertz方程和响应面方程所建立的初级模型和二级模型可以真实有效的反映微生物生长情况。如Neumeyer等[6]使用修正的Gompertz方程和响应面方程建立了不同储藏条件下冷却肉表面腐败微生物的预测模型；Powell等[7]使用响应面方程究了鱼类李斯特氏菌的致病菌预测模型：Malakar[8]等建立了果蔬食品乳酸杆菌和肠杆菌的生长动力学模型并预测了果
蔬食品的货架期；Smith-Simpson[9]等建立了波动条件下产气荚膜梭菌的生长模型。在此基础上，通过计算机程序可建立预测专家系统软件，如PMP和ComBase (www.combase.cc)数据库等。目前针对食品特定腐败菌模型的研究，国外已发表的用于肉类的食品特定腐败菌生长动力学模型有假单胞菌(Pseudomonas spp.)[10-11]和腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)[12]。国内主要对水产品中假单胞菌生长预测模型进行了研究[13]，而对气调包装冷却牛肉中假单胞菌预测模型建立的研究则很少见报道。
本实验以气调包装的冷却牛肉为材料，采集贮藏在不同温度条件下的优势腐败菌——假单胞菌的生长数据，使用修正Gompertz方程建立初级模型、通过响应面方程建立二级模型以及平方根方程研究温度对微生物生长的影响。旨在为构建三级模型即预测专家系统软件和快速估测冷却牛肉的货架期提供有效手段。
1 材料与方法
1.1 原料
整牛的去骨后腿肉购自上海某牛羊肉公司，在冰袋中保存，1h内运至实验室，立即分割成50～100g左右的肉块，进行气调包装。
1.2 储藏实验
将分割好的肉块分别按照80% O2、20% CO2和65% O2、35% CO2的体积比[14]，使用PET包装材料进行包装，置于0、5、1 0℃的冰箱中冷藏，在固定的时间间隔抽取样品进行微生物测定。
1.3 假单胞菌的计数
在肉块表面取25g样品，加入到225mL灭菌生理盐水中，搅拌均匀后，按10倍递增稀释到所需稀释度。每个稀释度取1mL倾注平板，共取3个稀释度，每个稀释度做两个重复，进行假单胞菌的测定，每组实验平行3次，取3次平均值为记录结果。根据ISO13720标准，使用假单胞菌选择性培养基30℃有氧培养2d并计数。
1.4 数学模型的建立
1.4.1 初级模型
修正的Gompertz方程式为[15]：
这是一个非线性的微生物生长模型，用实验所测的各种条件下的各种微生物的生长时间t和对应的微生物数量N值分别和方程式进行拟合(采用最小平方差的方法，通过Matlab7.0软件进行非线性回归)，求出4个参数，即lgN0、λ、lg()和μmax。
1.4.2 二级模型
响应面方程的公式为[16]：
y=b0+b1×M+b2×t+b3×M×t+b4×M2+b5×t2+δ
式中：y是受自变量影响的应变量，可以是细菌总数的延滞期或最大比生长速率μmax等；M和t是自变量，在本实验中它们分别为气调中的氧气体积分数和摄氏温度；δ是误差项，计算时可忽略。
1.4.3 温度对微生物生长影响的动力学模型
温度对假单胞菌生长影响的动力学模型由平方根方程描述[16]，方程式如下：
式中：t为摄氏温度/℃；tminμ和tminλ为生长的最低温度，即在此温度时最大比生长速率为零，b是方程常数。
1.4.4 模型的验证
通过微生物生长动力学模型求得的预测值与气调包装冷却牛肉实验所得的实际生长数值比较，依据Ross[17]与 Mellefont等[18]提出的用偏差度、准确度判定模型精确度。用偏差度检查预测值的上下波动幅度，用准确度衡量预测值和实测值之间的差异。偏差度和准确度用下式表示：
式中：Nprd为预测数值；Nobs为实测数值；n为实验次数。当偏差度和准确度值在：1)0.90～1.05，模型精确度高，误差小；2)0.70～0.90及1.06～1.15，模型的精确度可以接受，但误差较大；3)＜0.70或＞1.15，模型不可靠，不能用于模拟描述微生物生长等状况。
2 结果与分析
2.1 一级模型的拟合
使用假单胞菌选择性培养基结合Matlab7.0[19]软件，收集不同温度条件下的冷却牛肉储藏过程中假单胞菌的生长数据进行非线性回归，得到修正Gompertz函数方程的特征参数如表1。以t=5℃，80% O2气调为例，冷却牛肉在此冷藏条件下，其假单胞菌生长特征参数分别为：初始菌数量对数值3.0049、稳定期细菌数量最大的对数值6.7146、最大比生长速率0.4245、延滞期3.3947；
修正Gompertz方程的相关系数为0.9927，说明模型的拟合度高。图1表明了此条件下冷却牛肉中假单胞菌对数值随生长时间的变化规律。
图1 5℃、80% O2气调冷却牛肉中的假单胞菌生长曲线Fig.1 Growth curve ofPseudomonasspp. in chilled beef stored at 5 ℃in an MAP environment with 80% O2
表1 不同温度和气调比例的冷却牛肉中假单胞菌的特征参数值Table 1 Characteristic growth parameters ofPseudomonasspp. in chilled beef stored at difference temperatures and atmosphere ratios
表1所有函数方程拟合相关系数R2值都在0.99以上，说明所建立的模型能很好描述气调包装冷却牛肉在不同温度储藏条件下假单胞菌的生长变化规律。根据修正Gompertz方程拟合出气调包装冷却牛肉4个生长特征参数值，在0～10℃温度范围内，假单胞菌最大比生长速率(μmax)和生长延滞时间(λ)随贮藏温度不同发生显着变化，但延滞期随温度变化的规律性不如生长速率随温度的变化，这是因为延滞期受很多因素的影象，如计数时间。条件的波动和微生物种间的差异，这些因素都导致了对延滞期的估计总是比对生长速率估计的重复性要差，难度也很大[20-21]。
2.2 二级模型的拟合
利用Matlab7.0软件分析温度和气调包装对冷却牛肉中假单胞菌生长特征参数的影响，建立响应面方程，结果如下：
式中：M和t分别为氧气气调体积分数和摄氏温度。
2.3 温度对微生物生长动力学参数的影响
图1以及3种温度的Gompertz方程能很好地预测0、5、10℃温度条件下的假单胞菌的生长，但无法描述温度变化对假单胞菌生长的影响。温度对假单胞菌生长动力学的影响，一般可由平方根方程描述。以80% O2气调包装冷却牛肉为例，由图2可见，平方根方程描述的温度与最大比生长速率(μmax)、延滞时间(λ)呈现良好的线性关系。因此，可以用平方根方程评估温度对冷却牛肉细菌总数生长动力学的影响。
图2 80% O2气调包装冷却牛肉储藏温度与假单胞菌μmax和λ关系的平方根方程Fig.2 Square root equations of relationship between storage temperature andμmaxorλof Pseudomonas in 80% O2MAP packaged chilled beef
2.4 模型的验证
对研究对象而言，准确度的值越大，表明所得的结果越不好，如果所得的准确度为1则是模型拟合最理想的结果。表2为冷却牛肉在不同贮藏温度条件下假单胞菌的实测值与利用初级、二级预测模型求得此两种条件下假单胞菌预测值的比较，得到的残差值、偏差度和准确度。
表2 气调包装冷却牛肉生长参数的验证Table 2 Verification of characteristic growth parameters ofPseudomonasin MAP packaged chilled beef
从表2可知，气调包装冷却牛肉假单胞菌在不同温度储藏过程中的偏差度和准确度都在0.90～1.05范围内，说明建立的模型精确度高，误差小。因此，本实验建立的二级模型能准确预测气调包装冷却牛肉储藏在温度0～10℃范围内假单胞菌的生长状况。
3 结 论
3.1 本实验测得气调包装冷却牛肉的水分活度为0.98，初始pH值为5.71，在实验过程中主要考虑了温度对气调包装冷却牛肉微生物生长的影响，因有研究证明[22]：冷却肉的水分活度在大于等于0.98的范围内波动时，其对细菌的生长影响很小；pH值在5.3～7.8之间波动时不会对大多数微生物的生长速率造成影响。
3.2 本实验利用修正Gompertz方程建立假单胞菌生长的一级模型，响应面方程建立二级模型，结果表明：一级模型拟合相关系数R2均在0.99以上，二级模型偏差度和准确度均在0.90～1.05之间，因此所建立的模型能够真实准确的反应一定温度条件下气调包装冷却牛肉中假单胞菌的生长状况。有研究表明[22-23]：用此方法同样真实可靠的建立了冷却猪肉和罗氏沼虾微生物生长的一级模型和二级模型。
3.3 根据平方根方程以及修正Gompertz方程拟合气调包装冷却牛肉4个生长特征的参数值得知：在0～10℃范围内，假单胞菌最大比生长速率(μmax)和生长延滞时间(λ)随储藏温度不同发生显着变化，而则受温度的影响不大。
3.4 依据所建立的修正Gompertz方程结合响应面方程，将可以全面预测储藏在0～10℃范围内的冷却牛肉中假单胞菌的生长趋势和变化规律。
3.5 本实验是在恒定温度条件下进行的，如果冷却肉在实际生产流通过程中出现温度控制不当的情况，则现有模型就不能准确预测微生物的生长变化。因此，应该进一步研究温度波动条件下气调包装冷却牛肉中假单胞菌的生长动力学模型。
[1]MAN C M D, JONES A A. Shelf life evaluation of foods[M]. Gaithersburg Maryland USA: Aspen Publishers Inc, 1997: 110-139.
[2]LUND B W, GOULD G W. The microbiological safety and quality of food[M]. Gaithersburg Martland USA: Aspen Publishers Inc, 2000: 472-506.
[3]李正堂, 李柏林, 欧杰, 等. 市售冷却牛肉中主要细菌的常规分离与鉴定[J]. 微生物学通报, 2009, 36(2): 198-204.
[4]胡洁云, 欧杰, 李柏林, 等. 预报微生物学在食品安全风险评估中的作用[J]. 微生物学通报, 2009, 36(9): 1-7.
[5]MCKELLAR R C, LU X. Modeling microbial responses in foods[M]. USA: CRC Press LLC, 2003.
[6]NEUMEYER K, ROSS T, MCMEEKIN T A, et a1. Development of a predictive model to describe the effects of temperature and water activity on the growth of spoilage Pseudomonads[J]. International Journal of Food Microbiology, 1997, 38(1): 45-54.
[7]POWELL M R, TAMPLIN M, MARKS B, et a1. Bayesian synthesis
of a pathogen growth model: Listeria monocytogenes under competition [J]. International Journal of Food Microbiology, 2006, 109(1/2): 34-46.
[8]MALAKAR P K, MARTENS D E, ZWIETERING M H, et a1. Modeling the interactions between Lactobacillus curvatus and Enterobacter cloacae[J]. International Journal of Food Microbiology, 1999, 51(1): 67-79.
[9]SMITH-SIMPSON S, MARIA G, CORRADINI, et a1. Estimating microbial growth parameters from non-isothermal data: A case study with Clostridium perfringens[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 118(3): 294-303.
[10]LEBERT I, ROBLES-OLVERA V, LEBERT A, et a1. Application of polynomial models to predict growth of mixed cultures of Pseudomonas spp. and Listeria in meat[J]. International Journal of Food Microbiology, 2000, 61(3): 27-39.
[11]DOMINGUEZ S A, SCHAFFNER D W. Development and validation of a mathematical model to describe the growth of Pseudomonas spp. in raw poultry stored under aerobic conditions[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 120(3): 287-295.
[12]DALGAARD P. Modelling of microbial activity and prediction of shelf life for packed fresh fish[J]. Food Microbiology, 1995, 26(3): 305-317.
[13]许钟, 杨宪时, 郭全有, 等. 波动温度下罗非鱼特定腐败菌生长动力学模型和货架期预测[J]. 微生物学报, 2005, 45(5): 798-801.
[14]MCMILLIN K W. Where is MAP Going? A review and future potential of modified atmosphere packaging for meat[J]. Meat Science, 2008, 80 (1): 43-65.
[15]ZWIETERING M H, JONGENBURGER I, ROMBOUTS F M, et a1. Modeling of the bacterial growth curve[J]. Appl Environ Microbial, 1990, 56(6): 1875-1881.
[16]RATKOWSKY D A, OLLEY J, MCMEEKIN T A, et al. Relationship between temperature and growth rate of bacterial culture[J]. J Bacteriol, 1982, 149(1): 1-5.
[17]ROSS T. Indices for performance evaluation of predictive models in food microbiology[J]. J Appl Micmbiol, l996, 81(4): 50l-508.
[18]MELLEFONT L A, MCMEEKIN T A, ROSS T, et a1. Performance evaluation of a model describing the effects of temperature, water activity, pH and lactic acid concentration on the growth of Escherichia coli[J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 82(1): 45-58.
[19]张志刚, 刘丽梅. Matlab与数学实验[M]. 北京: 中国铁道出版社, 2004.
[20]李博. GDL豆腐中的主要腐败菌的研究及HACCP的建立[D]. 北京:中国农业大学, 2001.
[21]ROBINSON T P, OCIO M J, KALOTI A, et a1. The efect of the growth environment on the lag phase of Listeria monocytogenes[J]. International Journal of Food Microbiology, 1998, 44(1): 83-92．
[22]杨红菊, 南庆贤. 冷却猪肉主要腐败微生物生长模型的建立[J]. 前沿科技, 2004, 4(3): 4-10.
[23]范瑜敏, 李柏林, 欧杰, 等. 不同贮藏条件下罗氏沼虾细菌总数生长数学模型的研究[J]. 食品科学, 2007, 28(9): 418-421.
Mathematical Modeling for the Growth of Specific Spoilage Organisms in MAP Chilled Beef
HU Jie-yun1，OU Jie1,*，LI Bai-lin1，YAN Wei-ling2，LIN Lu2
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. Shanghai Food Research Institute, Shanghai 200235, China )
In this study, the growth models of Pseudomonas, one of the specific spoilage organisms, in chilled beef during storage at different temperatures in modified atmosphere packaging (MAP) environment were developed by Matlab7.0 to obtain Gompertz model parameters. A secondary model describing the growth of this specific spoilage organism and a kinetic growth model with temperature as the independent variable following the response surface and the square root equations, respectively, were constructed so as to validate the kinetic growth model at low temperatures ranging from 0 to 10 ℃. All the constructed Gompertz model displayed a correlation coefficient exceeding 0.99. The bias factor and accuracy of the secondary model were both between 0.90 and 1.05. These data demonstrate that the constructed primary and secondary models can both effectively predict the growth situation of Pseudomonas in chilled beef during storage in MAP environment at a temperature varying from 0 to 10 ℃.
chilling beef；modified atmosphere packaging；prediction model；specific spoilage organisms；Pseudomonas spp.
TS201.3
A
1002-6630(2010)21-0213-05
2009-12-18
“十一五”国家科技支撑计划项目(2007BAD52B05)；上海市科委重点科技攻关项目(10391902300)
胡洁云(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：hjy923@126.com
*通信作者：欧杰(1964—)，男，副教授，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail：jou@shou.edu.cn
