陈 萍，苗晓燕，张筱梅，周 强，孙文敬,3,*
(1.保定学院生化系，河北 保定 071000；2.百勤异VC钠有限公司，江西 德兴 334221；3.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)
利用荧光假单胞菌固定化细胞生产2-酮基-D-葡萄糖酸
陈 萍1，苗晓燕1，张筱梅1，周 强2，孙文敬2,3,*
(1.保定学院生化系，河北 保定 071000；2.百勤异VC钠有限公司，江西 德兴 334221；3.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)
以海藻酸钠为载体固定荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AR4，考察固定化细胞发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的条件。结果表明：利用5.0%海藻酸钠制备的固定化细胞颗粒稳定性好，可重复利用7次；发酵培养基中玉米浆的最适质量浓度为0.75g/100mL，固定化细胞的适宜发酵温度为30～36℃；在适宜的培养条件下，固定化细胞与游离细胞的2-酮基-D-葡萄糖酸产量及糖酸转化率基本相同，分别可达13.5g/100mL和90.0%左右。
固定化细胞；荧光假单胞菌；2-酮基-D-葡萄糖酸；海藻酸钠；发酵
Abstract：The cells ofPseudomonas fluorescensAR4 were immobilized by sodium alginate, and the optimization of fermentation conditions for producing 2-keto-D-gluconic acid by immobilized cells were investigated. The results showed that 5.0% of sodium alginate was the optimal carrier for immobilizingPseudomonas fluorescensAR4 to give a high yield, and the immobilized cells could be reused for 7 times. The optimal concentration of corn steep liquor in fermentation medium was 0.75 g/100 mL, and fermentation temperature was between 30 ℃ and 36 ℃. Under the optimal conditions, immobilized cells and free cells could give similar yield and conversion rate of 13.5 g/100 mL and 90.0%, respectively.
Key words：immobilized cell；Pseudomonas fluorescens；2-keto-D-gluconic acid；sodium alginate；fermentation
固定化细胞技术是保持生物催化剂稳定性、延长其使用寿命、增加生产能力的重要手段[1]。固定化细胞的制备方法主要有吸附法、共价结合法、交联法及包埋法等4类[2]。其中，包埋法是研究与生产中最常用的细胞固定化方法，具有方法简单、条件温和、稳定性好、机械强度较高等优点[3]。海藻酸钠是包埋法常用的载体之一，固化成形方便，对微生物毒性小，以其制备的固定化细胞密度高[4]，因此在细胞固定化中得到了广泛使用。目前有关固定化细胞在发酵工程中的应用研究较多[5-10]，但关于利用固定化细胞生产2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)的研究报道较少。
2KGA是生产食品抗氧化剂D-异抗坏血酸及D-异抗坏血酸钠的前体，工业上通常采用细菌发酵的方法由D-葡萄糖转化而来[11-12]。我国是目前国际上最大的2KGA生产国，生产规模达到了50000t/年，但在发酵生产中仍存在着能源消耗大、产物提取率不高、发酵菌体没有得到充分利用等问题[13]。本研究探索利用固定化细胞进行2KGA的发酵生产，以达到尽可能实现发酵菌体的循环利用、有效提高发酵产物纯度的目的。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AR4是以荧光假单胞菌A46为亲株诱变选育的抗噬菌体菌株[14]。
海藻酸钠为国产分析纯。培养基(g/L)：斜面培养基：牛肉膏5.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、琼脂20.0、pH7.0；种子培养基：葡萄糖20.0、玉米浆10.0、尿素 2.0、KH2PO42.0、MgSO4·7H2O 0.5、pH7.0；发酵培养基：葡萄糖140.0、玉米浆10.0、CaCO345.0、pH6.7。
752型分光光度计 天津拓普仪器有限公司；SBA-40型生物传感分析仪 山东省科学院生物研究所；WZZ-1SS数字式自动旋光仪 上海精密仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 固定化细胞的制备
游离细胞的培养及菌悬液的制备：将活化的斜面菌种分别接种于若干装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，30℃旋转式摇床(转速230r/min、偏心距25mm)振荡培养20h。取100mL种子培养液4000r/min离心20min，收集湿菌体。用生理盐水洗涤湿菌体两次，再用生理盐水将其制成0.25g/mL的菌悬液(约5×108cells/mL)。
固定化细胞的制备：按1:1的比例，将菌悬液分别与质量分数4.0%、4.5%、5.0%、5.5%的海藻酸钠溶液混合均匀。然后用无菌注射器将混合液缓慢滴入0.05 mol/L的CaCl2溶液中，形成直径约2.5mm的固定化细胞颗粒。待固定化细胞颗粒稳定成型后，用生理盐水洗涤两次备用。
1.2.2 固定化细胞的增殖培养
将一定量的固定化细胞(用2mL的菌悬液制备)加入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，30℃增殖培养20h。增殖结束后，用蒸馏水充分洗涤固定化细胞。
1.2.3 固定化细胞的发酵实验
将上述增殖的固定化细胞加入装有40mL发酵培养基的500mL三角瓶中，30℃旋转式摇床(转速230r/min、偏心距25mm)振荡培养72h。
1.2.4 固定化细胞的重复利用
发酵结束后，从发酵液中过滤分离固定化细胞，并用蒸馏水充分洗涤其表面残留物，然后将其重新加入装有40mL发酵培养基的500mL三角瓶中，30℃旋转式摇床(转速230r/min、偏心距25mm)振荡培养72h。
1.2.5 游离细胞的发酵实验
将2mL的菌悬液接入装有40mL发酵培养基的500mL三角瓶中，30℃旋转式摇床(转速230r/min、偏心距25mm)振荡培养72h。
1.2.6 测定方法
1.2.6.1 发酵液中游离细胞生长量(OD690nm值)的测定
用0.2mol/L的HCl稀释发酵液20倍，以水作空白，用752型分光光度计测定发酵液在波长690nm处的光密度，比色杯的光程为1cm。
1.2.6.2 发酵液中2KGA的测定
采用旋光法测定[14]。取一定量的2KGA发酵液，4000r/min离心20min以除去沉淀物。然后，取25mL的离心上清液与20mL的蒸馏水混合，搅动下用盐酸调节其pH值至1.5～1.6，再在60℃水浴中保温30min。用冷水将其冷却至25℃并用蒸馏水定容到100mL，再于4000r/min离心30min，所得上清液作为样品溶液。25℃条件下，测定样品溶液的旋光度及其葡萄糖质量浓度，根据下式计算发酵液中2KGA的质量浓度。
式中：Y为发酵液的旋光度/(°)；X1为发酵液中2KGA的质量浓度/(g/100mL)；X2为发酵液中葡萄糖的质量浓度/(g/100mL)；－0.88为1g/100mL 2KGA水溶液的旋光度/(°)；0.5275为1g/100mL葡萄糖溶液的旋光度 /(°)。
1.2.6.3 发酵液中葡萄糖的测定
取一定量的2KGA发酵液，4000r/min离心20min以除去沉淀物。然后，取离心上清液用蒸馏水进行适度稀释，在25℃条件下采用生物传感分析仪测定。
2 结果与分析
2.1 海藻酸钠质量分数对细胞固定化效果的影响
表1表明，随着海藻酸钠质量分数的提高，固定化细胞颗粒的强度明显增加，可重复利用次数增多，有利于固定化细胞制备成本的降低；但固定化细胞强度过大，其弹性势必有所下降，有碍底物和产物扩散，不利于菌体的生长和代谢。海藻酸钠质量分数减小，发酵液的OD690nm值增大，表明发酵过程中固定化细胞的菌体泄露增多，其可重复利用的次数减少。综合考虑，选用5.0%的海藻酸钠对荧光假单胞菌AR4进行固定化。
表1 海藻酸钠质量分数对细胞固定化效果的影响Table 1 Effect of sodium alginate concentration on cell immobilization
2.2 固定化细胞与游离细胞生产2KGA的比较
图1 固定化细胞与游离细胞生产2KGA的比较Fig.1 Comparative production of 2-keto-D-gluconic acid by immobilized cells and free cells
由图1可知，发酵60h时，游离细胞发酵液中2KGA的质量浓度已经达到13.30g/100mL，对葡萄糖的转化率达到88.0%以上，其发酵已接近终点，而此时固定化细胞发酵液中2KGA的质量浓度只有10.84g/100mL，对葡萄糖的转化率约为72.0%，说明固定化细胞的产酸速率较游离细胞慢；发酵72h时，游离细胞发酵液中2KGA的质量浓度几乎没有明显变化，而固定化细胞发酵液中2KGA的质量浓度明显增加至13.26g/100mL，对葡萄糖的转化率接近88.0%，说明固定化细胞具有与游离细胞相似的生产2KGA的能力。继续延长发酵时间，游离细胞及固定化细胞发酵液中2KGA的质量浓度均无明显增加，故将发酵实验的发酵时间设定为72h。
2.3 玉米浆质量浓度对固定化细胞生产2KGA的影响
图2 玉米浆质量浓度对2KGA产量的影响Fig.2 Effect of corn steep liquor concentration on 2-keto-D-gluconic acid production
图2表明，玉米浆质量浓度过大或过小均不利于固定化细胞2KGA的生产。当发酵培养基中玉米浆的质量浓度为0.75g/100mL时，固定化荧光假单胞菌AR4的2KGA产量及糖酸转化率最高。有实验[15]表明，培养基中葡萄糖质量浓度为14.0g/100mL时，游离细胞发酵生产2KGA的最适玉米浆质量浓度为1.5g/100mL左右。产生上述差异的原因可能是：固定化细胞在发酵前已经经过增殖，对氮源的需求量与游离细胞不同；游离细胞生长需要大量氮源，而固定化细胞在发酵培养基中生长相对缓慢，其氮源主要用于维持自身生理代谢。总体上讲，利用固定化细胞发酵生产2KGA所需的氮源量相对较少，有利于节约成本和发酵产物提取。
2.4 发酵温度对固定化细胞生产2KGA的影响
发酵温度对2KGA生产具有明显的影响。发酵温度过低，发酵周期明显延长；发酵温度过高，产物对糖的转化率降低[16]。从经济角度考虑，采用荧光假单胞菌AR4工业生产2KGA的发酵温度一般控制在33～36℃。本实验采用玉米浆质量浓度为0.75g/100mL的发酵培养基，在30～40℃的温度范围内考察发酵温度对固定化细胞生产2KGA的影响。
图3 发酵温度对固定化细胞生产2KGA的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on 2-keto-D-gluconic acid production by immobilized cells
图3结果表明，随着发酵温度升高，2KGA产量及糖酸转化率逐渐下降。30～36℃固定化细胞的产酸量及糖酸转化率较高，分别达到13.40～13.60g/100mL和88.78%～90.11%，表明固定化细胞的适宜发酵温度为30～36℃，与游离细胞的适宜发酵温度相近。发酵温度升至38℃时，2KGA产量及糖酸转化率明显降低，但仍分别达到12.87g/100mL和85.31%，说明AR4菌株生产性能稳定，产酸温度范围广，具有较好的高温发酵能力。
表2 重复利用固定化细胞生产2KGA的实验结果Table 2 Effect of repeated use of immobilized cells on 2-ket-D-gluconic acid production
2.5 固定化细胞的重复利用
固定化细胞被重复使用7次后，可能受到发酵液中离子腐蚀效应的影响，其机械强度明显下降，约有10%～20%的凝胶颗粒出现破裂现象，表现为发酵液中的菌体生长量明显增加，但其2KGA的产量及糖酸转化率没有发生明显变化(表2)。
3 结 论
使用质量分数5%海藻酸钠制备的固定化细胞稳定性好，可重复利用7次左右；固定化荧光假单胞菌AR4的产酸能力与其游离细胞基本相同，但产酸速率略低于游离细胞；固定化细胞发酵生产2KGA的适宜温度为30～36℃，与其游离细胞的适宜发酵温度相近；固定化细胞发酵生产2KGA的氮源需求量明显低于其游离细胞，有利于生产成本的降低及发酵产物的提取。
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Production of 2-Keto-D-Gluconic Acid Using ImmobilizedPseudomonas fluorescensAR4
CHEN Ping1，MIAO Xiao-yan1， ZHANG Xiao-mei1，ZHOU Qiang2，SUN Wen-jing2,3,*
(1. Department of Biochemistry, Baoding University, Baoding 071000, China；2. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China；3. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)
TQ814.2
A
1002-6630(2010)21-0258-04
2010-08-27
江苏大学科研启动基金项目(08JDG029)；江西省主要学科学术和技术带头人培养计划项目(2008DD00600)；江西省科技支撑计划项目(赣财教[2008]147号)
陈萍(1959—)，女，副教授，研究方向为生物科学。E-mail：xiaopuchen123@eyou.com
*通信作者：孙文敬(1964—)，男，研究员，博士，研究方向为生物化工。E-mail：sunwenjing1919@163.com
