令 博，田云波，吴洪斌，明 建,3,*
(1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.新疆农垦科学院农产品加工研究所，新疆 石河子 832000；3.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715)
微生物发酵法制取葡萄皮渣膳食纤维的工艺优化
令 博1，田云波1，吴洪斌2，明 建1,3,*
(1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.新疆农垦科学院农产品加工研究所，新疆 石河子 832000；3.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715)
以酿酒葡萄皮渣为原料，采用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌为发酵菌种，以发酵温度、发酵时间、接种量及料液比对水溶性膳食纤维(SDF)得率的影响为考察指标，通过单因素试验和均匀试验优化微生物发酵法制取葡萄皮渣膳食纤维的工艺。结果显示：发酵法制取葡萄皮渣膳食纤维的最佳工艺条件为：发酵温度40℃、发酵时间21h、接种量1%、料液比1:10，在此条件下得到SDF产率为(17.25±0.23)%，所制葡萄皮渣膳食纤维素的膨胀力、持水力和持油力分别为3.38mL/g、4.32g/g和1.87g/g，与原料相比膳食纤维的纯度和理化性质均得到一定提高。微生物发酵法制备膳食纤维的同时能有效提高其品质指标，是一种较好的高品质膳食纤维制备方法。
葡萄皮渣；膳食纤维；发酵法
葡萄是仅次于柑橘的世界第二大水果，葡萄皮渣(grape pomace，GP)即葡萄经酿酒后产生的残渣，主要由葡萄皮和葡萄籽组成，约占其总加工质量的20%。长期以来，GP被用于生产饲料、肥料或者做填埋处理，利用率很低，给生态环境也造成了一定破坏[1]。研究发现，葡萄皮渣中酚类物质(poly-phenolic compounds，PP)含量可达285～550mg/kg，总膳食纤维(total dietary fiber，TDF)含量可达干物质的70%以上[12]，因此，Saura-Calixo等[3]认为葡萄皮渣是一种极具开发价值的抗氧化膳食纤维(antioxidant dietary fiber，ADF)资源。
膳食纤维(dietary fiber，DF)通常是指能抗人体小肠的消化吸收而能在大肠被部分或全部发酵的可食用植物性成分(纤维素、半纤维素、木质素等)、碳水化合物及其类似物质的总称[4]。目前生产DF的原料通常来源于食品加工过程中的下脚料和废弃物，它们含有大量的水分、灰分、脂肪、淀粉和蛋白质等杂质，且对溶性膳食纤维(soluble dietary fiber，SDF)含量较低，因此在制备DF时首先需通过一定手段去除杂质提高DF的纯度，其次要增加膳食纤维中对人体健康发挥重要作用的SDF的含量改善其生理活性[5]。微生物发酵法是利用微生物液体发酵产酶，酶具有一定生物降解和转化作用的原理，使原料中的蛋白质、淀粉和脂肪等杂质分解，并使大分子分解成可溶性小分子，提高水溶性膳食纤维的含量。目前的研究多以食品发酵生产的传统菌种进行，其中以酸奶生产菌种保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌最为普遍，它们不仅对膳食纤维基料中的淀粉、蛋白质等杂质具有较强的分解能力，而且安全性较高，因此发酵法是一种相对安全、高效、低成本的高品质膳食纤维制备和改良方法[6]。本实验采用上述两种菌种对葡萄皮渣进行混菌发酵，以期获得具有较高纯度和品质的膳食纤维产品，为酿酒葡萄皮渣的综合利用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料、菌种与试剂
酿酒葡萄皮渣：葡萄品种为赤霞珠，由新疆中基西域葡萄酒公司提供。
葡萄皮渣经水洗除杂后烘干，粉碎过60目筛并收集筛下物。以无水乙醚浸泡上述粉体除去脂肪，最后用80%乙醇溶液洗涤残醚后烘干即为葡萄皮渣原料，密封贮存于阴凉干燥处备用。
保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)以1:1混合的菌种，购自哈尔滨美华生物技术股份有限公司。
脱脂乳粉 内蒙古蒙牛实业集团股份有限公司；白砂糖为食用级；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DHP-9082型电热恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司；TGL-16G型离心机 上海安亭科学仪器厂；JA2003型电子天平 上海精天电子仪器有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；SYQDSX-280A型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1F型超净工作台 苏州净化设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵剂的制备[7-8]
由于牛乳和脱脂牛乳是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的最佳培养基，因此当菌种要以葡萄皮渣为培养基前，需将葡萄皮渣原料逐步加入脱脂乳以驯化菌种使其适应葡萄皮渣培养基，具体方法如下：
菌种→100mL 10g/100mL的脱脂乳中37℃活化2次→50mL10g/100mL的脱脂乳＋50mL葡萄皮渣汁(蒸馏水:葡萄皮渣原料＝50:1，V/m)混合液37℃培养至凝乳2次→10mL10g/100mL的脱脂乳＋90mL葡萄皮渣汁(水:葡萄皮渣＝50:1，V/m)37℃培养至凝乳→发酵剂(以上菌种驯化过程需控制灭菌条件为105℃, 15min，并于超净工作台中接种)。
1.3.2 发酵法制备DF
1.3.2.1 DF的制备方法
准确称取10.00g葡萄皮渣于锥形瓶中，按一定料液比加入蒸馏水，然后加入皮渣质量2%的脱脂乳粉和1%的白砂糖，混合均匀后灭菌。冷却至室温后接入一定量的发酵剂，一定温度条件下发酵一定时间，发酵结束后抽滤，滤渣洗至中性后干燥即为水不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber，IDF)，向滤液中加入4倍体积95%的乙醇沉析后收集滤渣干燥即为SDF，合并上述滤渣即为TDF。以SDF的产率为衡量指标优化DF的制备工艺条件。
1.3.2.2 DF发酵工艺条件的单因素试验
准确称取葡萄皮渣原料10.00g于250mL锥形瓶中，分别以发酵过程中的温度、时间、接种量和料液比4个因素作单因素试验，考察各因素对水溶性膳食纤维SDF产率的影响(质量为干物质质量)。
设定pH值为7.0、发酵时间为24h、接种量为1%、料液比1:10，分别选取36、40、44、48℃为不同的发酵温度进行实验，发酵结束后计算SDF的产率。
设定pH值为7.0、发酵温度40℃、接种量为1%，料液比1:10，分别选取16、20、24、28h为不同的发酵时间进行实验，发酵结束后计算SDF的产率。
设定pH值为7.0、发酵温度40℃、发酵时间20h、料液比1:10，分别选取0.5%、0.75%、1%、1.25%为不同的接种量进行实验，发酵结束后计算SDF的产率。
设定pH值为7.0、发酵温度40℃、发酵时间20h、接种量1%，分别选取1:6、1:8、1:10、1:12为不同的料液比进行实验，发酵结束后计算SDF的产率。
1.3.2.3 均匀试验设计法优化工艺条件
通常发酵法制取DF时主要受发酵温度、时间、接种量和料液比4个因素的交叉影响，根据单因素试验结果，利用DPS-9.50软件，选择四因素五水平的均匀试验设计，以SDF产率为考察指标，研究4个因素对SDF产率的影响。选用因素和水平见表1。
表1 均匀试验设计的因素和水平设计表Table 1 Factors and levels used in uniform design
1.3.3 DF主要成分的测定
灰分的测定：采用高温灼烧法[9]；粗蛋白的测定：采用凯氏定氮法[10]；粗脂肪的测定：采用索氏抽提法[11]；膳食纤维：采用AOAC991.43的方法分别对SDF和TDF进行测定。
1.3.4 DF理化特性的测定
1.3.4.1 膨胀力的测定[12]
准确称取膳食纤维干样0.500g，均匀置于25mL刻度试管中后读取干品体积V0，加入20mL蒸馏水，振荡摇匀，于室温条件下放置24h，观察其自由膨胀体积V1。
1.3.4.2 持水力的测定[13]
准确称取膳食纤维干样0.100g，移入50mL离心管中后称质量m0，加入蒸馏水10mL，振荡摇匀，室温放置1h后5000r/min离心20min，小心弃去上清液后称质量m1。
1.3.4.3 持油性的测定
方法同持水力的测定。选用市售植物油测定DF吸附不饱和脂肪酸的能力。
1.3.4.4 阳离子交换力的测定[14]
称取0.500g膳食纤维干样，加0.1mol/L的HCl 20mL，摇匀，室温放置24h。滤纸过滤，用蒸馏水反复清洗除去多余的酸，转移残渣到三角瓶中，加入100mL 15g/100mL的NaCl溶液，磁力搅拌30min，以0.5%的酚酞乙醇为指示剂，0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定。用蒸馏水代替HC l，记录空白消耗的氢氧化钠的量。
式中：V1为样品消耗的NaOH体积/mL；V0为空白消耗的NaOH体积/mL；m为样品干质量/g；0.1为NaOH浓度/(mol/L)。
1.3.5 数据处理
数据采用Excel 2007统计分析，重复3次，结果用平均值±标准差表示，并用SPSS软件进行统计处理，采用ANOVA进行Turkey多重比较分析(P＜0.05)。
2 结果与分析
2.1 发酵温度对SDF产率的影响
图1 不同发酵温度对SDF产率的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on SDF yield
由图1可知，发酵温度对葡萄皮渣DF中SDF得率的影响较为显着，在整个发酵过程中SDF产率表现为先增加后减小的趋势，40℃时产率达最高值(15.15±0.78)%。由于温度是影响微生物生长的重要因素之一，微生物体内的众多生化反应均需要在一定温度下才能正常进行，而保加利亚乳杆菌的最适发酵温度为37℃，嗜热链球菌的适宜培养温度为42℃[15-16]，因此选择40℃为最适发酵温度。
2.2 发酵时间对SDF产率的影响
图2 不同发酵时间对SDF产率的影响Fig.2 Effect of fermentation time on SDF yield
由图2可知，随发酵时间的延长，SDF产率逐渐提高，当发酵20h后，SDF得率趋于稳定，可能是由于发酵24h后原料中营养物质耗尽，无法继续供给微生物存活扩增所需的营养物质，另外发酵时间过长还会导致次级代谢产物积累并产生有害物质，它们均会对菌体的生长产生不利，造成SDF产率下降。综合以上因素选取20h的发酵时间较为合理。
2.3 接种量对SDF产率的影响
图3 不同接种量对SDF产率的影响Fig.3 Effect of inoculum size on SDF yield
由图3可知，当接种量在0.5%～1%的范围内时随接种量增加，SDF产率也随之增加，当接种量超过1%时，SDF产率略有降低。可能是由于接种量过少时，发酵剂不能提供足够的活菌使葡萄皮渣完全发酵，导致SDF转化量较少；而接种量过大时由于菌体数量多，消化分解可能会迅速完成，在发酵后期造成菌株营养不足，培养液黏度增加溶氧不足，或可溶性糖类被分解利用，从而导致SDF的产率又有所降低[17]，因此接种量应选1%较为合理。
2.4 料液比对SDF产率的影响
图4 不同料液比对SDF产率的影响Fig.4 Effect of solid/liquid ratio on SDF yield
由图4可知，当料液比为1:10时SDF产率可达到峰值(15.10±0.45)%，过高或过低的料液比均会影响SDF的得率。其中料液比为1:6和1:8时，SDF产率明显偏低，可能是由于葡萄皮渣富含果胶类物质，经灭菌后培养基较为黏稠并出现结块现象，若加水量较少会导致发酵过程中氧气传递受阻、散热条件恶化，从而影响微生物的发酵使SDF产率较低；当料液比为1:12时，含量也较低，且料液比过高导致后期醇析时乙醇消耗量较大[18]。从经济角度考虑，可选择1:10为最佳料液比。
2.5 发酵工艺条件的优化
为增加试验点，选用均匀设计表U10，根据其使用表依次安排5个试验水平(1)～(5)。因均匀设计表U10为10水平表，而本试验中的4个因素均为五水平，因此采用拟水平法将表中各列的1、2水平取为对应于该列因素的因素水平表中的(1)水平，即：(1)→1、2，(2)→3、4,…,(5)→9、10，均匀设计法制备葡萄皮渣膳食纤维的试验结果见表2。
试验结果经DPS软件处理，用二次逐步回归分析方法[19]，确定多元二次回归方程，并对该模型进行显着性检验，回归方程的显着性检验及方差分析结果见表3。回归方程为：
由二次回归方程预测葡萄皮渣SDF产率的最大值及此时各因素的值，得到Xl＝40.4℃、X2＝20.9h、X3＝1.1%、X4＝1:9.5为最佳工艺参数。
表2 均匀设计法制备膳食纤维的试验结果Table 2 Uniform design arrangement and corresponding results
表3 回归方程的显着性检验及方差分析Table 3 Significance test and variance analysis of the fitted regression model
由软件分析可知，相关系数R＝0.99978，显着水平P＝0.0457＜0.05，剩余标准差s＝0.00079，Durbin-Watson统计d＝2.07511737，接近2，说明该方程能很好地拟合发酵法制备葡萄皮渣膳食纤维的过程，具有显着性。回归系数及变量分析结果见表4。
表4 回归系数及变量分析Table 4 Regression coefficients and their significance in the fitted regression model
从表4各变量偏回归分析的显着性检验P值大小可知，对葡萄皮渣SDF产率影响的大小为：X1＞X12＞X4＞X2X3＞X2＞X3X4＞X1X3＞X1X4。从回归的结果可知，因素之间存在交互作用，所以如果用单因素法很难得到一个较优方案。为验证模型方程的适用性，同时考虑到操作方便性，将上述条件调整为发酵温度40℃、时间21h、接种量1%、料液比1:10。平行进行5组实验，SDF的产率为(17.25±0.23)%，接近预测值。说明实验结果与模型拟合良好，建立的回归模型能真实的反映各因素对SDF产率的影响，通过此模型优化能够有效的提高SDF的产率。最终得到的SDF为白色蓬松状，IDF色泽为暗黄色，无异味，合并后即为葡萄皮渣DF，其样品颗粒大小均匀，无不良异味。
2.6 葡萄皮渣发酵前后基本成分及理化性质的比较
表5 葡萄皮渣膳食纤维的主要成分及部分功能特性Table 5 Main components physico-chemical properties of native and fermented grape pomaces
由表5可知，葡萄皮渣原料的主要成分为DF，其中TDF含量达69.61%，SDF含量约8.37%，其他成分含量均较低，可见葡萄皮渣是一种良好的膳食纤维资源，具有一定的开发价值。发酵后的产物中TDF提高至84.40%，SDF含量达17.25%，相比葡萄皮渣原料TDF含量和SDF含量分别提高了14.79%和8.88%，而其他杂质成分含量均有显着降低。说明微生物的消化分解作用，消耗掉了大部分营养物质，使得膳食纤维的纯度显着提高。葡萄皮渣经发酵后其DF的理化性质也得到了一定的改善，其中膨胀力、持水力及持油力3项指标分别达到了3.38mL/g、4.32g/g和1.87g/g，相比原料各项指标均有显着提高，原因可能是因为发酵后葡萄皮渣中DF的相对含量提高所致，但阳离子交换能力无显着变化。
3 结 论
3.1 葡萄皮渣是一种质优价廉的膳食纤维资源，利用混合菌种发酵法制备的TDF整体色泽较均匀呈微黄色，无异味，颗粒大小均匀，因此，酿酒葡萄皮渣是一种很有开发前景的农产品加工废弃物。
3.2 通过试验优化所得发酵法制取葡萄皮渣膳食纤维的最佳工艺条件为：发酵温度40℃、时间21h、接种量1%、料液比1:10，在此条件下SDF的产率可达(17.25±0.23)%，且膨胀力、持水力、持油力等理化性质较原料有显着提高。
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Optimization of Microbial Fermentation of Grape Pomace for Dietary Fiber Preparation
LING Bo1，TIAN Yun-bo1，WU Hong-bin2，MING Jian1,3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Instiute of Agro-food Science and Technology,Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation, Shihezi 832000, China；3. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400715, China)
Wine grape pomace was fermented with bothLactobacillus bulgaricusandStreptococcus thermophilusto prepare soluble dietary fiber (SDF). Four fermentation conditions affecting SDF yield including temperature, time, inoculum size and material-to-liquid ratio were optimized by one-factor-at-a-time and uniform design methods. The optimal fermentation conditions were determined as 40 ℃, 21 h, 1% and 1:10. Under these conditions, the SDF yield was (17.25 ± 0.23)%. The swelling capacity, water holding capacity and oil holding capacity of the prepared SDF were 3.38 mL/g, 4.32 g/g and 1.87 g/g respectively.Compared with the raw material, the purity and physico-chemical properties of the SDF were improved. In conclusion,microbial fermentation is a good method to prepare high-quality SDF.
grape pomace；dietary fiber；fermentation
R972.6
A
1002-6630(2012)15-0178-05
2011-09-05
国家“863”计划项目(2011AA100805-2)；新疆生产建设兵团工业科技攻关项目(2009GG39)；新疆生产建设兵团博士资金项目(2009JC12)
令博(1986 —)，男，硕士研究生，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：6lb6lb@163.com
*通信作者：明建(1972 —)，男，副教授，博士，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：mingjian1972@163.com
