刘晓庚，李凤月，张少青，潘建锋
(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏 南京 210003)
女贞果实的抗氧化性测定
刘晓庚，李凤月，张少青，潘建锋
(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏 南京 210003)
以南京产女贞果实为原料，考察不同提取剂对女贞果实不同部位(全果、果皮、核壳和果仁)提取所得提取液对DPPH自由基的清除效果，比较向阳面和向阴面不同生长期女贞果实的乙醇提取液对DPPH自由基的清除效果，研究固体状乙醇提取物的抗氧化性，测定女贞果实抗氧化的主要化学成分和固体状乙醇提取物的感官指标。结果表明：极性溶剂提取液表现出较强的清除DPPH自由基的能力；不同提取剂对女贞果实不同部位的提取物清除DPPH自由基能力的顺序为：甲醇、水的提取物为果皮＞全果＞核壳＞果仁，丙酮、乙酸乙酯、乙醇的提取物为果皮＞全果＞果仁＞核壳；提取物在低浓度区对DPPH自由基的清除作用与浓度成正相关，且斜率大大高于高浓度区，而高浓度区对DPPH自由基的清除作用与浓度的关系较复杂，表现为与提取剂密切相关。另外果实以成熟初期的提取物对DPPH自由基清除率最高，在成熟中期和过成熟期后均有不同程度下降，而且向阳面生长果实提取物对DPPH自由基的清除率显着高于向阴面果实提取物。抗氧化比较实验得到所制备的固体状女贞全果乙醇提取物抗氧化效果(IC50=5.38～10.46)与VC(IC50=8.59)相当，低于茶多酚(IC50=1.70)。另外，水溶性好、呈深咖啡色固体状的乙醇提取物有望成为一种新型高效抗氧化剂。
女贞果实；提取物；抗氧化性；抗氧化成分；DPPH自由基；清除率
Abstract：The DPPH radical scavenging effects of different solvent extracts from different parts ofLigustrum lucidumfruit growing in Nanjing were comparatively investigated. Moreover, the effects of sunlight illumination and growth period on the DPPH free radical scavenging activity of ethanol extract from wholeLigustrum lucidumfruit were examined, and the lyophilized ethanol extract from wholeLigustrum lucidumfruit was subjected to sensory evaluation and comparison with VC and tea ployphenols in free radical scavenging capacity. Polar and non-polar solvents were employed to extractLigustrum lucidumfruit,and the extracts derived from polar solvent extraction showed stronger DPPH free radical scavenging capacity. Solvents and fruit parts both made a difference to DPPH free radical scavenging capacity. The same solvent extracts from different fruit parts obtained with methanol, ethanol or water were ranked in the following order starting with the strongest:peel ＞ whole fruit ＞shell ＞ kernel. For acetone, ethyl acetate and ethanol extracts, the order was peel ＞ whole fruit ＞ kernel ＞ shell. All five solvent extracts from whole fruit showed a positive correlation between DPPH free radical scavenging activity and concentration in the lower concentration range, and the slopes were much higher than those in the higher concentration range. However, the concentration-effect relationship in the higher concentration range was complicated and closely associated with solvent type.The highest DPPH free radical scavenging activity ofLigustrum lucidumfruit was observed at the early ripening stage, followed by different decreases at the middle and post ripening stages. The ethanol extract fromLigustrum lucidumfruit exposed to sunlight revealed significantly higher DPPH free radical scavenging activity than that fromLigustrum lucidumfruit unexposed to sunlight.The lyophilized ethanol extract from wholeLigustrum lucidumfruit had a DPPH free radical scavenging capacity (IC50=5.38－10.46) equivalent to that (IC50=8.59) of VC but lower than that (IC50=1.70) of tea polyphenols. The solid water-soluble ethanol extract in dark brown is a potential effective antioxidant.
Key words：Ligustrum lucidumfriut；extract；antioxidant activity；antioxidant compound；DPPH radicals；scavenging rate中图分类号：R282.71 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)21-0058-04
女贞果实(Ligustrum lucidumAit)作为药食用已有2000多年历史，早在《神农本草经》就将其列为“延年”之品，而《本草纲目》记载：“女贞子……强阴，健腰膝，变白发，明目”。现代医药学研究表明女贞果实有降血糖、降血脂、抗菌消炎、降低眼压、抗血卟啉衍生物(HPD)光氧化作用以及保肝护肝和抗动脉硬化、抗癌、抗突变等功效[1]。目前已发现女贞果实的化学成分有萜类、黄酮类、苯醇类、多糖、脂肪酸、氨基酸、挥发油及其他化合物100多种[2]，它们大多具有抗氧化功能。植物抗氧化剂广泛应用于食品、医药、保健品和化妆品等行业，已建立了体外试管法、动物实验法和人体实验法等评价物质抗氧化活性。本研究以常用的体外试管法中应用最广、方法简便的2,2-二苯代苦味酰基苯肼基(2,2-Diphenyl-1-picryl hydrazyl，DPPH自由基)检测法来测定和评价女贞全果、果皮、果仁等可食性部分的抗氧化活性，以期开发女贞果实用作食用抗氧化剂。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
于2008年7月至2009年1月在无雨天或晴天，以采自南京市三叉河地区和南京财经大学校园内的成年女贞树不同生长期和生长部位的新鲜果实为原料，经脱粒、除杂、清洗、自然晾至表面无水珠后，手工将果实剥果分离出果皮、核壳和果仁，分别装瓶于冰箱中保鲜贮藏备用。
DPPH自由基试剂(分析纯) 日本和光纯药工业株式会社；茶多酚为自制精品；其他试剂均为国产分析纯；水为二次蒸馏水或去离子水。
UV1102分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；KH3000全波长薄层扫描仪 上海科哲仪器有限公司；高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；RE-52CS旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；BS224S电子分析天平 北京赛多利斯公司；TDL-80-2B离心机 上海安亭科学仪器厂；ALPHA1-4 LD微型冷冻干燥机 德国Marein公司。
1.2 方法
1.2.1 试液及固体提取物的制备
将女贞全果、果皮、核壳和果仁样品分别用捣碎机捣碎后称取约10g(准确至0.1g)，分别包裹好后再分别以不同的提取剂(用量100mL)在水浴上用索氏提取器提取至回流液无色，分离，提取液用相同的提取剂定容至100mL即为提取原液。将其置于冰箱避光冷藏，使用前以3000r/min离心10min，转移出清液备用。将用此法提取的全果80%乙醇提取原液经低温(≤50℃)真空浓缩脱除溶剂后，再冷冻干燥制成固体状女贞果实抗氧化物。
1.2.2 清除DPPH自由基能力的测定
准确称取DPPH试剂65.6mg (准确至0.01mg)，用95%乙醇溶解定容至250.0mL，即得0.2624mg/mL(6.65×10-4mol/L) DPPH贮备液，置于冰箱中避光冷藏备用，使用前用95%乙醇稀释。
将DPPH贮备液稀释至52.48mg/L使用液。在试管中依次加入4.0mL DPPH使用液，用80%乙醇稀释至10.0mL，混匀后置于25℃水浴中恒温5min，立即用1cm比色皿在517.5nm处(DPPH浓度与吸光度关系为A=0.0273cDPPH－0.0084，r2=0.9936)测吸光度(A0)；加入1.00mL待测样液，用95%乙醇稀释至10.0mL，混匀后置于25℃水浴中恒温5min，立即用1cm比色皿在517.5nm波长处测吸光度(Ar)；加入4.0mL DPPH使用液和1.00mL待测液，用95%乙醇稀释至10.0mL，混匀后置于25℃水浴中恒温5min，立即用1cm比色皿在517.5nm处测吸光度(As)。按式(1)计算自由基清除率(Y)[3]。
也可以采用清除单位质量DPPH自由基达到50%清除率时所加入抗氧化剂的质量来表示抗氧化剂清除DPPH自由基能力，即IC50值。IC50值越低，抗氧化剂的自由基清除能力越强[4]。按式(2)计算IC50值。
式中：mDPPH自由基为加入的DPPH质量/mg；m50为自由基清除率为50%时加入的试样溶液中溶质质量/mg(取5.00mL不同提取原液，用减压蒸发法烘干称质量)。
1.2.3 提取物成分的测定
参照文献[5]的薄层扫描法测定试样中齐墩果酸和熊果酸的含量；参照文献[6]的AlCl3显色光度法测定试样中总黄酮含量；参照文献[7]的苯酚-浓硫酸显色光度法测定试样中多糖含量。
2 结果与分析
2.1 女贞果实提取液抗氧化的主要化学成分分析
在查阅文献的基础上[1-3,5-10]，经薄层层析法定性比较分析和按1.2.3节测定方法进行定量测定，结果得女贞果实的抗氧化成分主要是花青素、单宁等酚类和齐墩果酸、熊果酸等三萜类，芹菜素等黄酮类，红景天皂苷等苷类和还原性多糖类等化合物。这些都属于水溶性化合物，因此女贞果实中抗氧化成分宜用极性的水溶性溶剂进行提取，这与本实验用极性不同提取剂得到的女贞果实提取物的抗氧化性强弱的实验结果(表1)相一致。
2.2 女贞果实提取液抗氧化性能的影响因素
2.2.1 不同提取剂提取物的抗氧化性
选用极性不同的提取剂对女贞果实样品提取得到的这些提取剂的提取效果存在明显差异。乙醇和甲醇提取物的组成基本一致，且含量较高；而水、丙酮和乙酸乙酯各自的提取物组成不一样，而且与乙醇和甲醇提取物的组成不同，含量与乙醇和甲醇提取物相比较低，提取效果最差的是非极性的环已烷。这是由于被提取物女贞果实样品的化合物组成和性质等不同的原因而形成的。另外，不同提取剂所得提取液的颜色有差别(表1)，这也表明各提取液的成分存在差异。由于果皮中含有的色素最高，且果皮占新鲜全果比例大，核壳主要含有多酚类色素，果仁主要是淀粉和脂肪酸等，所以，得到的提取液是果皮的颜色最深，全果的次之，果仁的颜色最浅。由于在果皮、全果、核壳和果仁中的色素成分不同，因此，在对不同提取剂所得到的提取液的颜色不一样。
图1 不同提取剂提取液的紫外-可见光谱Fig.1 UV scanning spectra of different solvent extracts from wholeLigustrum lucidumfruit
表1 不同提取物对DPPH自由基清除效果(2008-09-15采样)Table 1 Color and DPPH free radical scavenging capacity of different solvent extracts from different parts ofLigustrum lucidumfruit
由于女贞果实的抗氧化物主要是齐墩果酸、熊果酸、花青素、单宁、芹菜素和还原性多糖类等一些极性的化合物，因此，在提取上表现出极性溶剂提取液有较强的清除DPPH自由基的抗氧化性，而非极性环已烷的提取物无清除DPPH自由基的能力，其顺序为：果皮和全果的提取液是乙醇＞甲醇＞丙酮＞水＞乙酸乙酯＞环已烷，而果仁是乙醇＞甲醇>乙酸乙酯＞丙酮＞水≈环已烷，核壳是乙醇≈甲醇＞水＞丙酮＞乙酸乙酯>环已烷(表1)。另外，从表1还可看出，供试样品提取液清除DPPH自由基能力的顺序为：甲醇和水的提取液是果皮＞全果＞核壳＞果仁，丙酮、乙酸乙酯、乙醇的提取液是果皮＞全果＞果仁＞核壳。这是由于极性低的丙酮、乙酸乙酯有利于果仁中抗氧化性的脂肪酸的溶出，而强极性甲醇和水对脂肪酸的溶出能力较弱。
图2 不同质量浓度的不同提取液对DPPH自由基的清除率Fig.2 DPPH free radical scavenging rates of different solvent extracts from wholeLigustrum lucidumfruit at different concentrations
如图2所示，通过考察不同质量浓度的几种提取剂得到的提取物对DPPH自由基的清除率实验结果表明，乙醇、甲醇、丙酮、水和乙酸乙酯这5种溶剂的提取物在低质量浓度下均表现出对DPPH自由基有较强的清除作用，但其清除率与质量浓度的关系并不是简单的线性正比例，而是较为复杂关系，其中甲醇和乙醇提取物的质量浓度与清除率始终表现为正相关性，只是低质量浓度区的斜率大大高于高质量浓度区；而水提取物在低质量浓度区域内与清除率表现为正相关性，其后清除率相对稳定；丙酮和乙酸乙酯的提取物则是在低质量浓度区域内与清除率表现为正相关性，其后为负相关性，但并不显着。这一结果表明女贞果实提取物是高效的植物抗氧化剂。
2.2.2 女贞果实不同生长期和生长部位的抗氧化性
考察了女贞果实不同生长期和生长部位全果的乙醇提取液对DPPH自由基的清除率。经测定果实在未成熟期和成熟初期起抗氧化作用的主要成分花青素、单宁等酚类和齐墩果酸、熊果酸等三萜类等化合物，在成熟中期起抗氧化作用的主要成分齐墩果酸、熊果酸等三萜类，芹菜素等黄酮类和花青素、单宁等酚类等化合物，而在成熟后期和过熟期起抗氧化作用的主要成分齐墩果酸、熊果酸等三萜类和还原性多糖类等化合物，这些化合物的含量随生长期而改变。因此，表现出提取液对DPPH自由基的清除率在未成熟期随生长期延长而增加，到成熟初期达到高峰值，随后在成熟中则前期下降后期缓慢上升，到成熟后期达到略低于成熟初期的又一高峰值，随后明显下降。另外，生长在向阳面的果实提取液对DPPH自由基的清除率(33.96%～59.20%)明显高于向阴面的果实(20.03%～38.49%)，且两者在生长期的抗氧化的变化规律相一致。这为制得高品质女贞果实抗氧化物的原料质量控制提供了一定依据。
表2 女贞果实提取物的感官质量和抗氧化性比较实验结果(2008-09-15采样)Table 2 Sensory evaluation of lyophilized ethanol extract from wholeLigustrum lucidumfruit and comparison of IC50for scavenging DPPH radicals with VC and tea polyphenols
图3 不同采样日期不同部位女贞果乙醇提取液对DPPH自由基的清除率Fig. 3 DPPH free radical scavenging rates of ethanol extracts from wholeLigustrum lucidumfruit at different growth stages
2.3 女贞果实抗氧化提取物的感官分析及抗氧化性比较
由表2可见，实验制备的固体状女贞全果乙醇提取物为有色的粉末状水溶性物质，无异味，其抗氧化性与VC相当，但低于茶多酚。而且由于女贞果实是易得的原料，制备成抗氧化剂成本低，因此具有良好的发展前景。
3 结 论
女贞果实中含有丰富的水溶性且具抗氧化性的化合物，经测定其主要抗氧化成分是花青素、单宁等酚类，齐墩果酸、熊果酸等三萜类，芹菜素等黄酮类，红景天皂苷等苷类和还原性多糖类等化合物。其成分随果实生长期不同成分的组成和相对含量均有明显变化，因此，女贞果实提取物的抗氧化性也不一样，以果实成熟初期的抗氧化最高，在成熟中期和过成熟期后的抗氧化性均有不同程度下降。不同提取剂对女贞果实抗氧化成分的提取效果存在显着差异，对果皮和全果的顺序是：乙醇＞甲醇＞丙酮＞水＞乙酸乙酯＞环已烷；对果仁则是：乙醇＞甲醇＞乙酸乙酯＞丙酮＞水≈环已烷；而核壳是：乙醇≈甲醇＞水＞丙酮＞乙酸乙酯＞环已烷。生长于向阳面的女贞果实的抗氧化性显着高于生长于向阴面的果实。女贞果实提取物的抗氧化效率上表现出低质量浓度范围显着高于高质量浓度范围。通过抗氧化性的比较实验得到女贞果实乙醇提取物的抗氧化性(IC50=5.38～10.46)与VC(IC50=8.59)相当，低于茶多酚(IC50=1.70)。因此，女贞果实乙醇提取物是种高效的抗氧化剂。
固体状女贞果实乙醇提取物为深咖啡色，且有女贞果实特有的气滋味，水溶性好，能满足在糕点、面制品和饮料等多种食品应用的要求，但其应用实验和女贞果实乙醇提取物安全性实验等均有待进一步研究。然而女贞果实是一种在我国城乡分布很广泛、产量十分巨大的低廉植物资源，目前只在药用上有一定的开发利用，在食品上的开发利用却极少，因此，在食品上大力深入开发利用女贞果实具有重要价值。
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Determination of Antioxidant Activity of Extracts fromLigustrum lucidumFruit
LIU Xiao-geng，LI Feng-yue，ZHANG Shao-qing，PAN Jian-feng
(College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China)
2010-05-03
刘晓庚(1962—)，男，教授，硕士，主要从事应用化学与食品化学研究。E-mail：lxg_6288@163.com
