潘文娟，方婷婷，廖爱美,2，张海祥，魏兆军,*
(1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.合肥师范学院生命科学系，安徽 合肥 230061)
不同蚕蛹油中脂肪酸的性状及组分分析
潘文娟1，方婷婷1，廖爱美1,2，张海祥1，魏兆军1,*
(1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.合肥师范学院生命科学系，安徽 合肥 230061)
研究不同蚕蛹油的脂肪酸种类和相对含量。采用气相色谱-质谱方法，对KOH/CH3OH酯交换法甲酯化4种不同的蚕蛹油进行定量分析。结果表明：柞蚕蛹、蓖麻蚕蛹、家蚕蛹及剿丝后家蚕蛹油的酸价、皂化值和过氧化值存在显着差别；4种蛹油的脂肪酸成分的种类都以棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸为主，但含量存在显着区别；4种蚕蛹油中，柞蚕蛹油的不饱和脂肪酸相对含量是最高的，达77.29%；蓖麻蚕蛹油的α-亚麻酸相对含量最高，为50.52%；缫丝后家蚕蛹油不饱和脂肪酸的相对含量比缫丝前降低。
蚕蛹油；脂肪酸组分；气相色谱-质谱
蚕蛹是丝绸工业的大宗副产品，为药膳同源传统中药材，有很高的营养和药用价值，由于我国缺乏相应的深加工技术，目前蚕蛹基本上用作饲料和肥料，资源利用率和附加值低[1]。近年来, 卫生部批准蚕蛹是“作为普通食品管理的食品新资源名单”中唯一的昆虫类食品后，蚕蛹综合利用方面的研究日益得到重视，蚕蛹在营养保健食品、医药化工、生物防治等领域的应用呈现出良好的发展态势[2-4]。同时蚕蛹蛋白水解制的复合氨基酸含有人体生长发育所需的18种氨基酸，其中8种人体必需氨基酸(EAAs)含量高达42%以上，必需氨基酸与非必需氨基酸之比约为0.7[5-7]，符合联合国粮农组织世界卫生组织(FAO/WHO)所规定的理想蛋白质模式[8]。家蚕蛹油的提取工艺优化、组分分析及其功能等方面的研究已有报道，但是柞蚕和蓖麻蚕的蛹油提取、组分及其营养评价目前报道不多[9-10]。
本实验采用超临界CO2提取法对柞蚕、蓖麻蚕、剿丝前后的家蚕蚕蛹油脂肪酸进行提取，然后进行甲酯化处理，用气相色谱-质谱(GC-MS)计算机联用技术对蚕蛹油的脂肪酸成分进行了分析，通过检索Nist 98谱图库结合标准质谱图和有关文献[11]，运用峰面积归一化法，最终测定出各种脂肪酸的相对含量，为蚕蛹的深加工提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
柞蚕蛹 沈阳农业大学；家蚕蛹 安徽农业科学院蚕桑研究所；蓖麻蚕蛹 广西蚕业指导站；剿丝后蚕蛹 安徽双龙丝绸有限公司。
石油醚、丙酮、乙醇、乙醚、正己烷、甲醇、浓硫酸等均为分析纯；正己烷(色谱纯)；CO2(纯度99.9%)合肥金旺光源气体科技有限公司。
1.2 仪器与设备
HH-2恒温水浴锅 国华电器有限公司；SHY-2A型恒温水浴摇床 江苏金坛金城国胜仪器厂；R201旋转蒸发仪 上海申胜生物技术有限公司；HA121-50-01-C型超临界萃取装置 江苏南通华安超临界萃取有限公司；FE20 pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；EP2134C分析天平 上海奥豪公司； QP2010气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司。
1.3 4种蚕蛹油脂肪酸的提取方法
将蚕蛹在60℃条件下恒温烘至蚕蛹中的水分含量低于5%，然后粉碎，筛选60～80目的蚕蛹粉末供超临界提取应用，每次称取100g蚕蛹粉装入超临界原料提取桶内，在CO2流量25kg/h、萃取温度35℃、萃取时间2h、萃取压力25MPa、分离温度35℃和分离压力5.5MPa条件下萃取，即可得到淡黄色的蚕蛹油[12-13]。
1.4 脂肪酸甲酯(FAME)的制备
准确称取蚕蛹油样0.3～0.4g，加入1mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液3mL，60℃水浴约30min(至油滴完全消失)，冷却后加入40mL浓硫酸-甲醇(1:7，V/V)溶液，放入恒温振荡摇床中38℃、130r/min酯化12h，用正已烷萃取2次，合并萃取液，用饱和NaCl溶液洗涤多次，无水Na2SO4干燥，离心分层，取上清液FAME备用[14-15]。
1.5 FAME的GC-MS条件
色谱条件：色谱柱DB-WAX(30m×0.25mm，0.25 μm)；采用程序升温，初温200℃，保持1min，以3℃/min升温至230℃，保持10min，进样口温度和检测器温度分别为250℃和260℃，载气为高纯氦(He)，流速1.5mL/min；进样量1.0μL，分流比50:1。
质谱条件：电离方式为电子轰击(EI)，电子能量70eV，接口温度260℃，电子倍增器电压1.89kV；扫描范围 35～500u[16]。
1.6 蛹油的酸价测定
参照GB/T 5009.37—2003《食用植物油卫生标准的分析方法》。称取约1g油脂于250mL锥形瓶中，再加入10mL预先中和过的中性乙醚-95%乙醇(2:1，V/V)混合溶液，溶解油脂，再加入1～2滴酚酞指示剂，然后用0.1mol/L氢氧化钾溶液边摇边滴定，直到出现微红色，且在0.5min内不褪色。其反应过程为：RCOOH＋KOH→RCOOK＋H2O。
式中：AV为酸价/(mg KOH/g)；V为滴定试样所消耗氢氧化钾标准溶液的体积/mL；C为氢氧化钾标准溶液的浓度/(mol/L)；m为试样的质量/g；56.1为氢氧化钾的摩尔质量/(g/mol)。
1.7 蛹油的皂化值测定
参照GB/T 5534—1995《动植物油脂皂化值的测定》。称取0.194g柞蚕蛹油于锥形瓶中，再加入5mL 0.5mol/L氢氧化钾-乙醇溶液，加入一些助沸物，连接回流冷凝管，并将锥形瓶放在水浴锅中煮沸60min。再加入1～2滴酚酞指示剂于热溶液中，用0.5mol/L盐酸标准溶液滴定到指示剂粉色刚好消失为止，再做一组不加柞蚕蛹油的空白试验作对照。
式中：SV为皂化值/(mg KOH/g)；V0为空白所消耗盐酸标准溶液的体积/mL；V1为试样所消耗盐酸标准溶液的体积/mL；c为盐酸标准溶液的浓度/(mol/L)；m为试样的质量/g。
1.8 蛹油的过氧化值的测定
参照GB/T 5009.37—2003《食用植物油卫生标准的分析方法》。准确称取1.50～2.50g油脂于250mL碘量瓶中，加入30mL三氯甲烷-冰乙酸(2:3，V/V)，使试样完全溶解，加入1.00mL碘化钾饱和溶液，迅速盖好瓶塞，并轻摇0.5min，然后在15～25℃避光放置5min，之后取出加入100mL蒸馏水，立即用0.1mol/L的硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色，加入1mL淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失为止。不加试样，只用溶剂和试剂再进行空白实验。
式中：PV为过氧化值/(mmol/kg)；V1为测定样品所消耗硫代硫酸钠标准溶液体积/mL；V2为测定空白所消耗硫代硫酸钠标准溶液体积/mL；C为硫代硫酸钠标准溶液的浓度/(mol/L)；m为试样质量/g。
2 结果与分析
2.1 4种蚕蛹油的常规性状
这4种蚕蛹用超临界CO2流体提取的蚕蛹油都是浅黄色透明油状液体，4种蛹油的酸价、皂化值和过氧化值见表1。柞蚕蛹油的酸价最小为4.105mg KOH/g，缫丝家蚕蛹油的酸价最大为31.743mg KOH/g，这说明柞蚕蛹油中游离的脂肪酸量最少，而缫丝家蚕蛹油的游离脂肪酸量则是最大的。蓖麻蚕蛹油的皂化值最小为161.903mg KOH/g，家蚕蛹油的皂化值最大为198.87mg KOH/g，柞蚕蛹油及缫丝蛹油和家蚕蛹油的皂化值差不多，这说明蚕蛹油主要以甘油酯的形式存在，且蓖麻蚕蛹油以甘油酯形式存在的量相对小一些。家蚕蛹油的过氧化值最小为3.556mmol/kg，柞蚕蛹油的过氧化值最大为10.172mmol/kg，这说明柞蚕蛹油是这4种蛹油中最易发生氧化酸败的，相反，家蚕蛹油是这4种蛹油中最不易发生氧化酸败的，但是这4种蛹油的过氧化值都很小，所以都应该低温保藏。
表1 4种蚕蛹油的常规性状Table 1 Regular characters of four kinds of pupal oil
2.2 柞蚕蛹油组分分析
按上述实验步骤得出柞蚕蛹油的GC-MS总离子流色谱图(图1A)，通过数据处理系统，按峰面积归一化法分析确定的柞蚕蛹油中脂肪酸的相对含量列于表2。柞蚕蛹油中含有主要的8种脂肪酸，柞蚕蛹油以棕榈酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸为主，其中饱和脂肪酸的相对含量为22.51%，不饱和脂肪酸的相对含量为77.29%，其中单不饱和脂肪酸(如油酸)的相对含量为35.74%，多不饱和脂肪酸(如亚油酸、亚麻酸)的相对含量高达41.55%。
图1 4种蛹油的脂肪酸甲酯的GC-MS图Fig.1 GC chromatograms of fatty acid methyl esters (FAME) from four kinds of pupal oil
表2 柞蚕蛹油中脂肪酸种类及其相对含量Table 2 Fatty acid composition of oak silkworm pupal oil
2.3 蓖麻蚕蛹油组分分析
蓖麻蚕蛹油的GC-MS总离子流色谱图见图1B，脂肪酸的种类和相对含量见表3。蓖麻蚕蛹油的脂肪酸种类主要含有7种，以棕榈酸、油酸、α-亚麻酸为主，其中饱和脂肪酸相对含量为32.96%，不饱和脂肪酸相对含量为67.04%，其中单不饱和脂肪酸(如油酸)的相对含量为10.07%，多不饱和脂肪酸(如亚油酸、亚麻酸)的相对含量高达56.98%，是天然的医药保健食品。
表3 蓖麻蚕蛹油脂肪酸种类及其相对含量Table 3 Fatty acid composition of castor silkworm pupal oil
2.4 家蚕蛹油组分分析
家蚕蛹油的GC-MS总离子流色谱图和脂肪酸的种类和相对含量见图1C和表4。由表4可知，现行品种家蚕蛹油的脂肪酸种类主要含有6种，以棕榈酸、油酸、α-亚麻酸为主，饱和脂肪酸的相对含量为29.46%，不饱和脂肪酸的相对含量为70.54%，其中单不饱和脂肪酸(如油酸)的相对含量为26.61%，多不饱和脂肪酸(如亚油酸、亚麻酸)的相对含量为43.92%。
表4 家蚕蛹油的脂肪酸种类及其相对含量Table 4 Fatty acid composition of domestic silkworm pupal oil
2.5 缫丝后家蚕蛹油组分分析
缫丝后家蚕蛹油的GC-MS总离子流色谱图和脂肪酸的种类和相对含量见图1D和表5。由表5可知，剿丝厂下脚料蚕蛹油的脂肪酸主要含有6种，以棕榈酸、油酸、α-亚麻酸为主，饱和脂肪酸的相对含量为38.50%，不饱和脂肪酸的相对含量为61.50%，其中单不饱和脂肪酸(如油酸)的相对含量为40.15%，多不饱和脂肪酸(如亚油酸、亚麻酸)的相对含量为21.35%。
表5 剿丝厂的蚕蛹油脂肪酸种类及其相对含量Table 5 Fatty acid composition of desilked silkworm pupal oil
3 讨 论
本实验以柞蚕蛹、蓖麻蚕蛹、家蚕蛹及剿丝后家蚕蛹为原料，采用超临界CO2流体萃取蚕蛹油，然后用GC-MS比较分析出了这4种蚕蛹油组分的种类和含量差异。4种蚕蛹油的酸价、皂化值和过氧化值存在显着差别，柞蚕蛹油的酸价最小，缫丝家蚕蛹油的酸价最大，酸价大小代表游离脂肪酸的多少，游离脂肪酸容易与空气中的氧气发生氧化作用，而使油脂产生哈喇味，由于游离脂肪酸是造成油脂变坏的根本原因，因此油脂中游离脂肪酸越少越好，也就是酸价越小越好，在这4种油中，柞蚕蛹油的酸值最小，也最接近食用油酸价标准，是一种最具潜力的新型食用油开发资源；蓖麻蚕蛹油的皂化值最小，家蚕蛹油的皂化值最大，皂化值的高低表示油脂中脂肪酸相对分子质量的大小(即脂肪酸碳原子的多少)，皂化值愈高，说明脂肪酸分子量愈小，亲水性较强，失去油脂的特性；皂化值愈低，则脂肪酸分子量愈大或含有较多的不皂化物，油脂接近固体，难以注射和吸收，所以食用油需规定一定的皂化值范围，同时皂化值大小间接反映油脂中脂肪酸组成及甘油含量，同时利用油脂皂化值可计算出以油脂为基础的相关衍生物技术参数，从而指导生产；家蚕蛹油的过氧化值最小，柞蚕蛹油的过氧化值最大，过氧化值是衡量油脂酸败程度，一般来说过氧化值越高其酸败就越厉害，过氧化值升高是反映油脂品质下降、油脂陈旧的指标。由于柞蚕蛹油最易发生氧化酸败，所以应该低温储藏。
4种蚕蛹油的组分和含量存在显着差别，采用同样方法分析表明，柞蚕蛹油种类最多，为8种，蓖麻蚕7种，缫丝前后的家蚕蛹油为6种。柞蚕蛹油的不饱和脂肪酸相对含量是最高的，高达77.29%；蓖麻蚕蛹油的α-亚麻酸相对含量最高。缫丝后家蚕蛹油不饱和脂肪酸的相对含量比缫丝前降低，造成不饱和脂肪酸降低的原因有很多，其中最主要的原因可能是缫丝过程中有些蚕蛹被煮沸，缫丝后常温保存一段时间后不饱和脂肪酸发生了氧化酸败。
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Character and Fatty Acid Composition of Silkworm Pupal Oil
PAN Wen-juan1，FANG Ting-ting1，LIAO Ai-mei1,2，ZHANG Hai-xiang1，WEI Zhao-jun1,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；
2. Department of Life Science, Hefei Normal University, Hefei 230061, China)
In order to determine the types and relative contents of fatty acids in 4 kinds of silkworm pupal oil, oil transesterification was carried out with KOH/CH3OH, followed by gas chromatography-mass spectrometric analysis. Results indicated that acid values, saponification values and peroxidation values differed significantly among the 4 kinds of pupal oil. All the four tested materials contained the following major components: linolenic acid (LNA), palmitic acid, stearic acid, oleic acid andα-linolenic acid, which exhibited different relative contents. Among them, the relative content of unsaturated fatty acids in oak silkworm pupal oil was the highest, which was up to 77.29% and castor silkworm pupal oil contained the mostα-linolenic acid, with a relative content of 50.52%. Desilked pupal oil contained more unsaturated fatty acids than silkworm pupal oil.
silkworm pupal oil；fatty acid compostion；gas chromatography-mass spectrometry
R284.1
A
1002-6630(2011)04-0148-04
2010-10-26
安徽省“十一五”科技攻关项目(08010302149)；教育部新世纪优秀人才基金项目(NCET-07-0251)；安徽省第四批优秀青年科技基金项目(08040106803)
潘文娟(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为功能食品。E-mail：wenjuanpan12345@163.com
*通信作者：魏兆军(1970—)，男，教授，博士，研究方向为功能食品。E-mail：zjwei@hfut.edu.cn
