超高效液相色谱法同时测定饮料中5种人工合成色素

张 婉，王 覃，杜 宁，周 悦，李津廷，张经华*

(北京市理化分析测试中心，北京 100089)

超高效液相色谱法同时测定饮料中5种人工合成色素

张 婉，王 覃，杜 宁，周 悦，李津廷，张经华*

(北京市理化分析测试中心，北京 100089)

目的：建立超高效液相色谱同时测定饮料中5种人工合成色素(柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝)的检测方法。方法：样品采用聚酰胺吸附法提取色素，通过Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18反相色谱柱分离，以甲醇-0.02mol/L乙酸铵缓冲溶液为流动相进行梯度洗脱，于254nm和629nm波长处检测。结果：5种人工合成色素在5.5min内完成分离，3～80mg/L范围内呈良好线性关系(r＞0.9995)，检出限为0.03～0.10mg/L，平均回收率为97.4%～107.3%，RSD为0.22%～3.20%。结论：该方法简便、快速、分离效果好、灵敏度高，适用于饮料中人工合成色素的测定。

超高效液相色谱法；人工合成色素；饮料

食品着色剂分为天然色素和人工合成色素，其中，人工合成色素由于具有色泽艳丽、性质稳定、着色力强、配色方便和价格低廉等优点，在食品生产、加工行业中被广泛应用。但是，人工合成色素主要是以苯、甲苯、萘等化工产品为原料，经过磺化、硝化、卤化、偶氮化等一系列有机反应制成的，有的还含有β-萘胺和α-氨基萘酚等致癌物，过多食用会危害人体健康。因此，食品中人工合成色素有着严格的控制使用范围和最大使用量，其测定具有重要意义。

目前，人工合成色素的检测方法有薄层色谱法[1]、高效液相色谱法[1-2]、高效液相色谱-质谱联用法[3-4]、极谱法[1]、光度法[5]、毛细管电泳法[6]。对于多组分合成色素混合物的分析，薄层色谱法操作繁琐，且定量准确度较差；液相色谱法是目前应用最为普遍的分析方法；色谱-质谱联用法虽然在分辨率和灵敏度方面有一定优势，但其仪器昂贵，推广应用受到一定限制；极谱法受干扰因素影响较多，定性较为困难；光度法需要结合一些化学计量学方法，数据处理较为复杂；毛细管电泳法则重现性较差。而超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，UPLC)技术与传统的液相色谱(HPLC)技术相比，大幅度改善了分析速度、分离度、样品通量和灵敏度，该技术目前已在食品安全、环境分析、药物开发等领域得到应用。本实验旨在建立UPLC同时测定饮料中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝5种人工合成色素的分析方法，并探讨本方法与HPLC法、毛细管电泳法相比的优势，以期为人工色素的分析方法的确定提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

5种饮料样品购自市场，分别为橙味饮料(1#)、维生素功能饮料(2#)、葡萄汁饮料(3#)、橙味汽水(4#)、运动饮料(5#)。

柠檬黄、苋菜红、日落黄、胭脂红和亮蓝标准品(GBW(E)100001a～5a) 中国计量科学研究院；甲醇(色谱纯) 美国Fisher公司；其余试剂均为分析纯；实验用水为超纯水。

ACQUITYTM超高效液相色谱仪[配有高压泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(PDA)、Empower色谱工作站] 美国Waters公司；Milli Q纯水仪 美国Millipore公司；CP224S电子天平 瑞士Metteler Toledo公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；流动相：甲醇(A)-0.02mol/L乙酸铵(B)梯度洗脱；流速：0.25mL/min；样品室温度：25℃；柱温：30℃；进样量：2.5μL；检测波长：254nm和629nm；检测器采样速率：20点/s。

1.3 标准溶液的配制

将质量浓度0.5g/L的色素单标溶液，根据需要混合，并用超纯水稀释成质量浓度分别为3.0、5.0、10.0、20.0、50.0、80.0mg/L的混合标准溶液，经0.22μm滤膜过滤后，进行UPLC测定。

1.4 样品的制备

称取饮料试样15g，置于100mL烧杯中，对碳酸饮料样品加热驱除二氧化碳。加20g/100mL柠檬酸调节试样pH值到6，加热至60℃，加入1g聚酰胺粉，充分搅匀，以G3垂融漏斗抽滤，用60℃ pH4的去离子水洗涤3次(10mL/次)，然后用甲醇-甲酸(6:4)溶液洗涤3次(10mL/次)，再用水洗涤至中性，用无水乙醇-氨水-水(7:2:1)溶液解吸3～5次(10mL/次)，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至10mL。定容后的样品经0.22μm滤膜过滤后，进行UPLC测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 梯度洗脱条件的选择

采用甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液体系作为流动相，考察不同配比下5种色素的分离情况。结果表明：采用梯度洗脱的方式，柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄很容易实现基线分离，而亮蓝存在同分异构体，若梯度变化过快，3种异构体的色谱峰不能分离。因此，在前4种色素得到良好分离后，进行1.5min的等度洗脱，然后再加大甲醇的洗脱体积分数，使亮蓝的3种同分异构体实现基线分离。方法选用的梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution program

2.1.2 检测波长的选择

5种人工合成色素均为水溶性酸性染料，结构中含有数量不等的苯磺酸基，在紫外区有较强的特征吸收。因此，国家标准方法和大多数文献报道的方法选用254nm作为以上5种人工合成色素的检测波长。但实验发现：亮蓝在254nm波长处的灵敏度很低，难以满足实际检测需要。所以，本实验采用PDA检测器进行全波长扫描(扫描范围210～700nm)。实验结果表明：以上5种人工合成色素除了在紫外区有着较强特征吸收外，由于各种色素的结构中含有不同的发色及助色基团，在可见光区也有最大吸收波长。5种色素最大吸收波长分别为柠檬黄：257.4、427.1nm；苋菜红217.2、521.8nm；胭脂红216.0、508.4nm；日落黄234.9、484.1nm；亮蓝307.4、628.2nm。由此选择254nm作为柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄4种人工合成色素的检测波长，629nm作为亮蓝的检测波长。在相应的检测波长下，5种人工合成色素响应值高，背景干扰小。

2.1.3 柱温的选择

实验考察25、30、35℃柱温条件下5种人工合成色素的分离效果，结果表明：对于色谱柱温的改变，各组分的保留时间和灵敏度变化不明显，但随着柱温的增加柱压有所降低，因此，实验选用30℃作为分析的柱温条件，既接近常温，又有较小的柱压。

2.1.4 流速的选择

流速大小会影响柱压、洗脱时间和分离度。实验考察0.25、0.35、0.50mL/min 三种流速下5种人工合成色素的分离效果，结果表明：随着流速的增加，分析时间相应缩短，在0.5mL/min流速时，4.0min内可完成分离。但是，在该条件下，柱压有所升高，色谱峰变宽，柱效降低，且综合考虑检测大量样品时溶剂的消耗量，本实验选择0.25mL/min为最佳流速。在最佳色谱条件下，对标准样品和实际样品进样分析，结果见图1。

图1 5种人工合成色素标准品(a)和1#饮料样品(b)色谱图Fig.1 Chromatograms of mixed five pigment standards and beverage sample No. 1

2.2 线性关系及检出限

将一系列不同质量浓度的混合标准溶液依次进样分析，在3～80mg/L(n=6)质量浓度范围内，各人工合成色素组分均与其各自对应的峰面积呈线性关系(r＞0.9995)。各色素的保留时间、线性方程、相关系数和检出限(RSN=3)见表2。

表2 5种人工合成色素的保留时间、线性关系、相关系数和检出限Table 2 Retention times, linear equations, correlation coefficients and detection limits of five synthetic pigments

2.3 精密度和稳定性

以一定质量浓度的混合标准溶液进行6次日内和5次日间测定，分别对5种色素标准物质作定性(保留时间)、定量(峰面积)统计分析，结果表明：5种人工合成色素保留时间的日内RSD＜0.4%、日间RSD＜0.7%；峰面积的日内RSD＜0.5%、日间RSD＜2.7%，显示该仪器方法的定性定量精密度和稳定性均能满足分析要求。

2.4 回收率实验

称取等量已测定本底值的1#饮料样品6份，分别按5.00mg/L和30.00mg/L 2个添加水平加入混合标准溶液，每个添加水平3份，按1.4节方法制成待测溶液后进行分析测定。结果表明：5种人工色素的回收率为97.4%～107.3%，RSD为0.22%～3.20%。实际加标样品的色谱图见图2。

图2 1#饮料加标样品的色谱图Fig.2 Chromatogram of spiked beverage sample No. 1

2.5 检测方法应用

对市售的5种饮料样品进行测定，根据各化合物峰的保留时间和吸收光谱进行定性，外标峰面积法定量，结果见表3。

表3 饮料样品检验结果Table 3 Pigment contents in beverage samples determined by this method

我国GB 2760—2007《食品添加剂使用卫生标准》[7]规定：食品中柠檬黄和胭脂红的最大使用限量为0.05g/kg，苋菜红、日落黄、亮蓝为0.025g/kg，通过实验检测出4个饮料样品中含有的5种人工合成色素均未超出国家标准。

3 讨论与结论

本实验建立的UPLC法具有以下特点：首先是分析速度快，分离5种人工合成色素仅需5.5min；而文献报道的HPLC法[2]需时12min，毛细管电泳法[6]需时15min。其次，对于5种人工合成色素分离效果好。由于采用小颗粒填充的短柱，因此具有较高的柱效和较低扩散体积。实验采用了梯度洗脱程序，使得柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄及亮蓝的3种同分异构体都实现了良好的基线分离。此外，灵敏度有明显提高。使用PDA双通道波长检测，各色素特别是亮蓝的检测灵敏度有了较大提高，5种色素的检出限为0.03～0.10mg/L，而HPLC法为0.30～1.40mg/L，毛细管电泳法为0.02～0.18mg/L。最后，UPLC法节省溶剂。由于分析时间和流动相流速的区别，本法分析一次样品所消耗的溶剂量仅为1.62mL，而HPLC法需8.40mL。

本实验建立的使用UPLC同时检测饮料中人工合成色素的方法，快速、简便、准确、灵敏，适用于实际饮料样品的检测工作。

[1] GB/T 5009.35—2003 食品中合成着色剂的测定[S].

[2] 王春荣, 张济, 刘岚铮. 食品中多种合成色素的反相高效液相色谱法测定[J]. 中国公共卫生, 2005, 21(3): 359-360.

[3] 陈晓红, 李小平, 姚浔平. 高效液相色谱-质谱联用法测定饮料中人工合成色素的研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2005, 15(8): 941-942.

[4] 李帮锐, 冯家力, 潘振球, 等. 高效液相色谱-质谱/质谱联用法测定饮料中的人工合成色素[J]. 中国卫生检验杂志, 2007, 17(4): 579-581.

[5] 贾燕, 张克荣, 郑波. 偏最小二乘法-分光光度法同时测定多种食用合成色素[J]. 重庆医科大学学报, 2005, 30(2): 260-262.

[6] 赵新颖, 贾丽, 周晓晶, 等. 毛细管电泳同时测定糖果中5种人工合成色素的含量[J]. 现代仪器, 2008(4): 58-60.

[7] GB 2760—2007 食品添加剂使用卫生标准[S].

Determination of Five Synthetic Pigments in Beverage by Ultra Performance Liquid Chromatography

ZHANG Wan，WANG Tan，DU Ning，ZHOU Yue，LI Jin-ting，ZHANG Jing-hua*
(Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China)

Objective: To develop an ultra performance liquid chromatography (UPLC) method for the determination of five synthetic pigments such as tatrazine, amaranth, carmine, sunset yellow and brilliant blue in beverage. Methods: Synthetic pigments in beverage were extracted by polyamide adsorption method, separated on a Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18 column by gradient elution using a mobile phase made up of methanol and 0.02 mol/L ammonium acetate, and detected at 254 nm and 629 nm. Results: The five synthetic pigments were separated in 5.5 min. The UPLC method exhibited excellent linearity over a range of 3－80 mg/L (r ＞ 0.9995). The detection limit, recovery rate and relative standard deviation (RSD) of this method were 0.03－0.10 mg/L, 97.4%－107.3%, and 0.22%－3.20%, respectively. Conclusion: The analytical method is simple, accurate,sensitive and suitable for the determination of pigments in beverage.

ultra performance liquid chromatography；synthetic pigment；beverage

O657. 63

A

1002-6630(2011)04-0177-04

2010-04-14

北京市科学技术研究院创新团队项目(IG200801N/C2)

张婉(1984—)，女，实习研究员，硕士，主要从事理化检验研究。E-mail：wanzhang@yahoo.cn

*通信作者：张经华(1958—)，男，研究员，博士，主要从事分析化学及天然产物分离提纯研究。E-mail：z_j_h2006@yahoo.com.cn