黎园园，董庆利*，梁 娜，胡孟晗
解冻猪肉的有害菌鉴定及其再生长研究
黎园园，董庆利*，梁 娜，胡孟晗
(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093)
采用选择性培养基对-18℃冻藏5d后解冻的猪肉中有害菌进行计数，并对各选择性培养基上的典型菌落进行分离纯化和初步鉴定，进而对各种有害菌在4、0、-5℃的再生长进行研究。结果表明假单胞菌属、热死环丝菌、肠杆菌科是解冻猪肉中存在的优势有害菌。在4℃和0℃贮藏的过程中各有害菌均有增长，假单胞菌和热死环丝菌增长最快，菌数最多；-5℃贮藏过程有害菌增长缓慢，甚至有所减少。
解冻猪肉；有害菌；再生长
解冻肉是指冷冻肉吸收热量使肌肉组织中的冰晶融化从而达到冷冻前的新鲜状态。冷冻肉作为肉类储备和企业加工的原材料可以在低温状态下储存很长时间，在肉的流通过程中起着重要的作用。冷冻肉在加工或食用前均需解冻，采取何种解冻方法能使解冻后肉的品质最高，解冻后如何贮藏才能最大的保持肉的营养价值和感官价值，以及贮藏过程中微生物变化等问题有待研究。
对解冻肉的研究，国内外已有不少的报道。余小领等[1]对不同冻结解冻速度对猪肉的保水性和超微结构进行了研究，Lee等[2]、Zhao等[3]、Li等[4]对肉类解冻方法进行研究，叶盛英等[5]对冻结肉喷射声空化场解冻技术进行初探。研究表明不同的解冻方法对肉的品质如色泽、肉汁损失率等有一定的影响。对解冻肉中微生物情况，以及贮藏过程中微生物的再生长规律，国内外少有报道。
经研究表明肉中的有害菌有假单胞菌属、不动杆菌属、热死环丝菌、肠杆菌科及其他致病菌如沙门氏菌[6]等。本实验以-18℃冻藏5d后解冻的猪肉为例研究其中有害菌的初始情况并进行分离和初步鉴定，以及不同温度贮藏过程中的再生长变化，以期为肉类工业质量控制提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
宰后48h的新鲜猪精腿肉 市购。于实验室中分割成30g左右的样品，迅速置于-18℃冰箱中冻结5d取出于空气中自然解冻3h后备用。
PCA培养基(plate count agar)、PSA培养基(pseudomonades selective agar)、STAA培养基(streptomycin thalliumacetate actidion agar)、VRBGA琼脂(violet red bile gluc agar)、MRS琼脂(man rogosa and sharpe agar)、葡萄糖氧化发酵培养基(O/F培养基)和Thornley氏精氨酸双水解酶试验培养基(thornley arginine eihydrolase test medium)的配制参见文献[7]。
革兰氏染色液、1%盐酸二甲基对苯二胺、3%～10% 过氧化氢、1% α-萘酚酒精(95%)溶液和液体石蜡；上述所有试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
Autoclave SS-325型灭菌锅 日本Tomy Kogyo公司；XW-80A型漩涡混合器 上海精科实业有限公司；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱 上海华连医疗器械有限公司；ECCIPSE型显微镜 日本尼康公司；HWS-150型恒温恒湿培养箱 上海比朗仪器有限公司；WAECO CF50型冰箱 美国电子(深圳)有限公司；SPX-250B-Ⅱ型生化培养箱、S·SW-CJ-IC型净化工作台 上海跃进医疗器械厂。
1.3 解冻猪肉的初始有害菌计数
随机选取3个解冻猪肉典型样品进行初始有害菌计数，取样方法参照GB 4789.2—2008《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》[8]方法。初始有害菌采用选择性培养基及培养条件如表1所示。
表1 解冻猪肉中各种有害菌的培养基及培养条件Table 1 Culture media and culture conditions for counting harmful bacteria in thawed pork
1.4 有害菌的分离及初步鉴定
从各选择性培养基上挑取典型生长菌落数株，然后在相应的选择性培养基上反复划线分离，得到纯化的菌落。
菌落形态主要包括：分离纯化得到的单个菌落的大小、形态、隆起程度、边缘结构、表面状态、光泽度、透明度、质地和颜色等。进而挑取菌落进行革兰氏染色，观察单个细胞的形状和细胞间的排列方式。
不同的微生物的生理生化特征鉴定参考文献[9-10]，主要包括氧化酶试验、过氧化氢酶试验、葡萄糖氧化发酵试验和精氨酸双水解试验等。
1.5 不同温度贮藏下解冻猪肉的有害菌再生长
将解冻后猪肉样品分别置于4、0、-5℃条件贮藏，解冻后立即采用选择性培养基倾注平板进行各种菌落计数，并记为0d，以后每2d取样进行计数直至第8天。
1.6 数据处理与分析
应用SPSS 16.0软件进行数据处理，采用方差分析进行邓肯氏多重检验分析，并用Origin 8.0软件进行图形绘制。
2 结果与分析
2.1 解冻猪肉中初始有害菌分析
采用选择性培养基对3个平行的解冻猪肉样品的菌落总数、假单胞菌属、热死环丝菌、肠杆菌科和乳酸菌数进行测定，结果如表2所示。
表2 解冻猪肉初始有害菌分析Table 2 Numbers of total viable bacteria and harmful species of bacteria in thawed pork
从表2结果可以看出，假单胞菌属与热死环丝菌是解冻猪肉中的优势有害菌，平均菌数与其他菌数差异显着(P＜0.05)，后续的贮藏实验也表明这两种优势菌增长最快。同时，假单胞菌属(5.68 lg(CFU/g))与热死环丝菌(5.56 lg(CFU/g))的菌数高于了菌落总数(4.77 lg(CFU/g))，分析原因是由于PCA培养基不能使所有的菌都生长或者未体现其他菌的竞争性。
解冻猪肉中的优势有害菌其次是肠杆菌科，对数平均值为4.21lg(CFU/g)。乳酸菌数量最少，解冻猪肉中乳酸菌的存在会对优势有害菌的生长产生一定的抑制作用[11]。从表2结果还可以看出，菌落总数对数平均值超过了4lg(CFU/g)，有研究认为肉中初始菌数应控制在102～103CFU/g会利于保存[12]，本研究后续的贮藏期较短也验证了这一点。有研究认为猪肉在屠宰分割及冷冻过程中由于工艺不完善[13]和员工操作不规范等原因，会使微生物指标超标，影响肉的质量，也增大了不安全因素。因此实际生产中不能忽略加工工艺对解冻猪肉中微生物的控制作用。
2.2 解冻猪肉中有害菌的初步鉴定
通过菌落形态观察、革兰氏染色及生理生化实验，对来源于PSA、STAA、VRBGA、MRS平板并经过划线分离得到的纯菌株进行初步鉴定，结果如表3所示。
表3鉴定结果可以进一步说明假单胞菌属、热死环丝菌和肠杆菌科是解冻猪肉中的优势有害菌。
表3 解冻猪肉中优势有害菌的初步鉴定结果Table 3 Preliminary identification of harmful bacteria in thawed pork
2.3 不同贮藏温度下解冻猪肉有害菌再生长
用不同的选择性培养基，对不同贮藏温度下解冻猪肉中有害菌的生长规律进行研究，结果如图1所示。
图1结果表明，在4℃条件下菌落总数及各种菌增长都很快(图1A)，从第4天起假单胞菌属和热死环丝菌数量显着高于乳酸菌和肠杆菌科(P＜0.05)；菌落总数、假单胞菌属和热死环丝菌到第8天时对数值达到8.5 lg(CFU/g)左右；肠杆菌科后期增长较快，对数值在7.5 lg(CFU/g)左右，高于乳酸菌(7.0 lg(CFU/g))，说明假单胞菌属、热死环丝菌和肠杆菌科在4℃贮藏过程中再生长占优势，这与傅鹏等[14]的研究结果一致。一般研究认为菌落总数值达到107时肉的外观有明显的腐败现象，达到108时外表有黏液形成，不宜加工或食用[12]。
0℃条件下的有害菌变化趋势与4℃条件下类似，但增长较缓(图1B)。从第0天起假单胞菌和热死环丝菌数量已经显着高于其他菌(P＜0.05)，且在贮藏后期这两种菌均有较明显的增长，其他菌基本趋于平衡。说明假单胞菌属和热死环丝菌在低温条件下易于生长，是低温条件下的优势有害菌，肠杆菌和乳酸菌受到一定的抑制，生长速率明显低于假单胞菌属和热死环丝菌，随着温度的降低，这种差异越明显，这与Li等[15]的报道一致。
图1 解冻猪肉在不同贮藏温度下有害菌的再生长Fig.1 Regrowth of harmful bacteria from thawed pork in various selective culture media at various temperatures
图1 C所示的-5℃条件下菌落总数及其他菌均未见明显增长，甚至在贮藏初期还有所下降，最后趋于平衡，原因可能是冻结解冻的过程造成的温度的波动及低温贮藏条件对各有害菌有损伤。结合图1A和图1B，进一步表明假单胞菌属和热死环丝菌是解冻猪肉在低温贮藏中再生长速率较快的优势有害菌，这与大多数报道一致；虽然在0℃和-5℃条件下肠杆菌科细菌数量较少，增长缓慢，但是在4℃条件下增长较快，也是有害的能导致腐败的细菌之一；从乳酸菌的数量和增长情况可以看出，乳酸菌不是优势的导致腐败的有害菌。本实验结果与傅鹏等[14]、Russo等[16]的研究一致。
3 结 论
3.1 对解冻猪肉中初始有害菌的分析可知，假单胞菌属、热死环丝菌、肠杆菌科和乳酸菌是解冻猪肉中的初始有害菌。通过对不同的选择性培养基上典型菌落进行初步分离鉴定，得出假单胞菌属、热死环丝菌和肠杆菌科是解冻猪肉中的优势有害菌。
3.2 从解冻猪肉中不同贮藏温度下菌落总数与各类细菌的生长来看，假单胞菌属与热死环丝菌增长最快，在4℃和0℃条件下均有不同程度的增长，肠杆菌科在4℃条件下增长也较快，乳酸菌数量最少，增长很慢。肉类工业应采取相应措施控制解冻猪肉中有害微生物的增长。
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Identification and Regrowth of Harmful Bacteria in Thawed Pork
LI Yuan-yuan，DONG Qing-li*，LIANG Na，HU Meng-han
(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)
Pork that had been stored for 15 days at -18 ℃ was thawed to count harmful bacteria using different selective culture media, typical colonies growing on culture medium plates were separated and preliminarily identified, and an investigation into the regrowth of various harmful bacteria was carried out at 4, 0 or -5 ℃. It was found that the dominant harmful bacteria in thawed pork were Pseudomonas spp., Brochothrix thermosphacta, Enterbacteriaceae. Each harmful bacterium could grow at 4 or 0 ℃of storage temperature. Further studies showed that Pseudomonas spp. and Brochothrix thermosphacta grew faster than others, with more colony forming units (CFU) observed. While most of the harmful bacteria grew slower at -5 ℃, and even decreased to some extent.
thawed pork；harmful bacteria；regrowth
TS251.51；TS251.44；TS207.4
A
1002-6630(2011)04-0251-04
2010-05-10
国家自然科学基金项目(30800864)；上海高校选拔培养优秀青年教育科研专项(slg-07049)
黎园园(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为畜产品安全与质量控制。E-mail：nishang1015@yahoo.com.cn
*通信作者：董庆利(1979—)，男，副教授，博士，研究方向为畜产品安全与质量控制。E-mail：dongqingli@126.com
