魏战峰，田忙雀，王 玥，杨水云
(1.咸阳市疾病预防控制中心，陕西 咸阳 712000；2.西安市粮油质量检验中心，陕西 西安 710003；3.西安交通大学生命科学与技术学院，陕西 西安 710049)
明胶掺假乳制品快速检测方法的建立
魏战峰1，田忙雀2，王 玥3，杨水云3
(1.咸阳市疾病预防控制中心，陕西 咸阳 712000；2.西安市粮油质量检验中心，陕西 西安 710003；3.西安交通大学生命科学与技术学院，陕西 西安 710049)
目的：建立一种明胶掺假乳制品的快速定性方法。方法：采用硝酸汞溶液沉淀乳蛋白，进一步用苦味酸溶液检测明胶，通过敏感度测定试剂用量。结果：用1.4g/100mL硝酸汞溶液沉淀乳蛋白的最佳用量为乳品体积的1/2；用苦味酸检测明胶的敏感度为30mg/100mL。结论：该方法快速、方便，灵敏度高，可做成试剂盒，满足实际样品检测要求。
掺假乳；明胶检测；试剂盒
目前，鲜牛乳掺假的现象越来越严重，这不但影响产品的质量，使乳品厂陷入困境，也严重侵害了消费者的利益[1-2]。为此，很多乳品厂都加强了鲜奶收购的管理与监督。
明胶是胶原蛋白的水解产物[3]，而胶原蛋白则是动物体内含量最丰富的蛋白质。其来源广泛，水解工艺粗放廉价，很易取得[4-5[6-7]，属于不完全蛋白，不能提供足够的营养价值。乳中加入廉价的明胶能提高乳蛋白和非脂固体的含量，增加假乳的密度和比重[8-9]，以掩盖牛乳掺水的本质[2,10]，而现行国标法(凯氏定氮法)却无法检出。因此，为了加强牛乳的卫生监督和管理，必须正确快速判断原料奶中有无掺入明胶。
常规的明胶检测方法是首先将明胶完全水解之后检测其中特有的羟脯氨酸的存在与含量[4,11-13]，该法要求条件高且耗时长，不适宜开发成便携式快速检测产品。据报道[14]，用硝酸汞和苦味酸可以分步沉淀乳制品中的乳蛋白和明胶，从而对牛乳中有无明胶的存在进行定性检测。但此法仅限于粗糙的描述没有细化检测条件，也没有形成检测产品。本研究旨在建立乳制品中明胶的定性检测方法，并形成便携的试剂盒产品，使市场上和原料奶收购中明胶掺假乳品的快速定性检测成为可能。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
液态纯牛奶 银桥乳品厂。
1.4g/100mL硝酸汞(分析纯)；2,4,6-三硝基苯酚(化学纯)；3g/L明胶(化学纯)；250g/L硝酸银(分析纯)；浓硝酸(65%～68%)。
硝酸汞溶液：7g硝酸汞，50mL去离子水，加浓硝酸1.25mL，加热全溶解后加去离子水至500mL；饱和苦味酸溶液：2g苦味酸加去离子水至100mL，煮沸，冷却至室温，待有结晶析出时，倒出上清液待用；明胶母液：3g明胶加100mL去离子水，淡黄色半透明溶液，微波加热中高火1min至溶解；硝酸银溶液：5g硝酸银溶解于20mL去离子水中，微热，搅拌至溶解完全；稀硝酸溶液：0.25mL浓硝酸加50mL去离子水。
1.2 敏感度的测定
用硝酸汞溶液沉淀乳蛋白，进一步用苦味酸溶液检测明胶。通过敏感度测定来决定试剂用量，配制不同浓度梯度的明胶掺假牛奶，加硝酸汞溶液，离心后取上清液加饱和苦味酸溶液。与阴性对照做对比，观察溶液是否变浑浊。变浑浊者为阳性，仍保持透明清亮者为阴性。以能使溶液变浑浊的明胶最低加入量为明胶检测的下限，即敏感度。
1.3 实验条件的优化
1.3.1 硝酸汞用量
在第一步沉淀反应中，如果硝酸汞用量不足，将不能完全沉淀乳蛋白，使上清液不能澄清而造成假阳性。为了避免假阳性出现，必须寻找能够沉淀最大乳蛋白含量的硝酸汞用量，以保证假乳中的乳蛋白彻底沉淀。取不同量的硝酸汞溶液，分别加入等量纯牛奶中，离心沉淀后比较各上清液澄清度。取能使上清液完全澄清的硝酸汞最低加入量作为其最适添加量。
1.3.2 离心条件
寻求最低的离心转速和时间，可以使该产品在实际应用中得到更为宽泛粗放的离心条件。以标准试剂体系和模拟假乳的加入量，在不同条件下离心。取能够达到实验要求的最低离心转速和最短时间为最适离心条件。
2 结果与分析
2.1 方法敏感度的测定
在含有不同量明胶模拟假乳的试管中加入硝酸汞沉淀乳蛋白后，取各上清液，加入等量苦味酸，观察生成沉淀情况，结果见表1。
表1 敏感度测定中明胶的不同掺入量与实验现象Table 1 Experimental phenomena corresponding to varying amounts of glutin in simulated adulterated milk samples
由表1可知，3号管有明显的混浊和沉淀发生，而4号管溶液清亮不能检出明胶存在，因此估计3号管中的明胶水平为该方法的检测下限，即敏感度，因此本方法检测明胶的下限不高于30mg/100mL。可见本方法具有相当高的敏感度，足以满足掺假乳制品中明胶的检出。
2.2 实验条件的优化
2.2.1 消除假阳性的硝酸汞用量优化
在等量纯牛奶中加入不同量的硝酸汞溶液，离心沉淀后比较各上清液澄清度。硝酸汞溶液加入量和实验观察结果如表2所示。
表2 硝酸汞用量测试结果Table 2 Selection of optimum amount of Hg(NO3)2 solution addition μL
从表2可知，5号管中硝酸汞用量为能使乳蛋白完全沉淀的最低用量，依此比例关系配备试剂盒中试剂。而管6、7中的硝酸汞用量不足，不能使乳蛋白完全沉淀而可能造成后期检测的假阳性，因此确定管5中的硝酸汞用量为检测用最低用量。因此取牛乳量1/2体积的1.4g/100mL硝酸汞溶液，就能使纯奶乳蛋白完全沉淀，而假乳中乳蛋白含量不会超过纯乳中乳蛋白含量，故此量的硝酸汞溶液也能使假乳上清液完全澄清。
2.2.2 离心条件的优化
在不同离心条件下离心，目测离心后上清液的澄清度，得到如下两种最适离心条件：5000×g离心30s，或者1100×g离心3min。
2.3 检测方法说明及实际样品测定
试剂盒使用说明如下：取500μ L待测乳制品于1.5mL离心管(盛有250mL试剂1)中，颠倒混匀。10000r/min离心30s，取上清液100μL于试剂2中。颠倒混匀，观察结果。与阴、阳性对照进行对比，如果试管中溶液为与阴性对照相似的澄清淡黄色溶液，说明所测乳品中不含明胶；如果试管中溶液为与阳性对照相似的混浊样黄色溶液，说明所测乳品中含有明胶。本试剂盒中试剂，除过对照可以反复借鉴使用外，其余试剂为一次性使用产品，不得反复使用，否则不对结果负责。本品能检测出明胶掺假量在300mg/L以上的假乳制品。
试剂盒对实际样品的检测结果如图1所示，表明检测效果明显。
图1 试剂盒检测结果Fig.1 Detection of glutin-adulterated milk by a reagent kit developed based on this method
3 讨论与结论
牛乳主要成分酪蛋白具有良好的乳化性，即在细小的酪蛋白颗粒表面包裹了一层水化膜，从而使大颗粒的蛋白稳定悬浮于乳品中。当加入金属盐离子(汞离子)后，盐离子将会破坏酪蛋白颗粒表面的水化膜，从而使酪蛋白颗粒互相聚合而沉淀。而明胶本身是水溶性的，分子质量比酪蛋白又要小得多，盐离子对其影响小，不会使明胶沉淀。
苦味酸即2,4,6-三硝基苯酚，是一种有机酸，具有与三氯乙酸、水杨酸、鞣酸、过氯酸等相似的蛋白沉淀作用，被称为生物碱试剂，即植物体内具有显着生理作用的含氮碱性化合物，是能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质。生物碱试剂与蛋白质的碱性基团(氨基、亚氨基、羟基、胍基等)反应。而明胶常见的三肽单元Gly-Pro-Hyp，其中脯氨酸含有侧链氨基，羟脯氨酸含有一个亚氨基。 苦味酸与明胶的这些碱性基团反应，从而沉淀明胶。
本实验成功研制了一种便携式快速检测明胶掺假乳制品的方法，进行一次乳品检测只需4min左右，所形成产品形式为试剂盒。1个份次的试剂由分别盛有硝酸汞(试剂1)和苦味酸溶液(试剂2)的2支离心管组成，每个试剂盒配备阴、阳性对照管各一只。按照顾客对所需要检测的乳品份次，可灵活配备试剂盒中的试管数量。
本产品的形成尚需要配备离心机设备。在以后的方法改良中，还可以尝试过滤方法去除乳蛋白而检测滤液中是否有明胶存在以省却离心机；所用试剂为毒性试剂，可以进一步研发对环境和人体无毒的绿色试剂。
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Development of A Rapid Detection Method for Glutin-adulterated Milk
WEI Zhan-feng1，TIAN Mang-que2，WANG Yue3，YANG Shui-yun3
(1. Xianyang Center for Disease Control and Prevention, Xianyang 712000, China；2. Cereals and Oils Quality Test Center of Xi’an, Xi’an 710003, China；3. College of Life Science and Technology, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710069, China)
Objective: To develop a method for the rapid qualitification of glutin-adulterated milk. Methods: For the precipitation of milk proteins, Hg(NO3)2 solution was used, and the supernatant resulting from centrifugation was then added with saturated picric acid solution. After thorough mixing, whether or not the reaction system becomes turbid was identified by comparison with a negative control. The sensitivity of the established method was evaluated by using simulated adulterated milk samples with varying amounts of glutin. Meanwhile, Hg(NO3)2 solution amount and centrifugation conditions were optimized. Results: Addition of a half volume of 1.4 g/100 mL Hg(NO3)2 solution to milk samples provided optimum precipitation of milk proteins. The detection sensitivity of the method for glutin was 300 mg/100 mL. Conclusion: This method is rapid, convenient and highly sensitive, and has the potential to be developed into reagent kit products, which can meet the requirements for detection of real samples.
adulterated milk；glutin；reagent kit
TS207.3
A
1002-6630(2011)04-0220-03
2010-03-25
魏战峰(1963—)，男，副主任技师，学士，主要从事微生物检验研究。E-mail：wzf5625@126.com
