1-甲基环丙烯对‘香水’梨果实品质和挥发性成分及相关基因表达的影响

赵江丽，何近刚，岳盈肖，闫子茹，冯云霄，程玉豆，关军锋,*

（1.河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所，河北 石家庄 050051；2.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001）

‘香水’梨（Maxim）属秋子梨系统，果实呈圆形，直径4～6 cm，单果质量130 g左右，味道甘甜、微酸，深秋成熟，果皮黄绿色，采收时质硬，在采后贮藏过程中逐渐变得柔软多汁，并产生浓郁的香味物质，品质优良，深受消费者喜欢。但‘香水’梨果实在常温下贮藏10 d左右即开始软化，之后腐烂，货架期较短。因此，研究贮藏保鲜技术以延长‘香水’梨的货架期具有重要意义。

梨是典型的呼吸跃变型水果，其采后的成熟衰老过程与乙烯的诱导作用密切相关。1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）是乙烯作用的抑制剂，能有效抑制果实乙烯生成，延缓果实衰老，有效延长果实的保鲜时间，在果实采后处理中得到广泛应用。研究发现，1-MCP处理可显着推迟库尔勒香梨在贮藏过程中硬度、可溶性固形物含量（soluble solids content，SSC）和可滴定酸含量的降低，抑制呼吸强度和乙烯释放；降低安梨果实的呼吸强度和乙烯释放量，维持果实内在品质和果皮颜色亮度，延缓果实衰老，抑制低温贮藏后货架期黑皮病发生；有效延缓‘南果’梨的硬度降低、维持内在品质、延长货架期。

香气是水果品质评价的重要指标之一，是果实内部挥发性成分（volatile organic components，VOCs）共同作用的结果，与果实的糖、氨基酸、脂肪酸等营养成分合成密切相关，可以一定程度反映果实的成熟、衰老和腐烂等生理变化。研究认为1-MCP对果实的VOCs生成有重要影响，如减少梨果实的香气物质，下调香气生成相关基因的表达。本课题组早期研究发现，1-MCP可以延缓‘香红’梨果实的后熟进程，抑制乙烯和部分VOCs的合成，但1-MCP处理对果实的乙烯生成及其信号转导以及VOCs合成相关基因表达影响的研究较少。

本研究以‘香水’梨为材料，考察了1-MCP处理对其果实品质、呼吸和乙烯生成特性、VOCs组成变化的影响，并对其乙烯和香气物质生成相关基因的表达模式进行分析，以期进一步解析作用机理，为1-MCP在‘香水’梨贮藏保鲜中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘香水’梨于2019年9月18日采自河北省承德县，果实接近完熟，当天运回实验室，室温（（25±1）℃）过夜，挑选大小均一、无病虫害和机械损伤的果实（平均单果质量20.6 g；硬度6.65 kg/cm；SSC 6.65%），并随机分为两组，即处理组（1.0 μL/L 1-MCP熏蒸处理）和对照（CK）组（空气），1-MCP处理18 h后，将果实置于室温（（25±1）℃）条件下存放。贮藏期间，每3 d进行果实呼吸速率和乙烯释放速率的测定，每6 d测定果实品质，同时取果皮和果肉进行液氮速冻后，在-80 ℃下贮藏备用。每次取平行样品3 份，每份重复测定3 次。

1-MCP 美国AgroFresh公司；2-辛酮 日本东京化成工业株式会社；氯化钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒、TB Green™ Premix ExII聚合酶链式反应（polymease chain reaction，PCR）试剂盒 宝生物工程（大连）有限公司。所有用水均为高纯水。

1.2 仪器与设备

GY-4型果实硬度计 浙江托普仪器有限公司；PAL-1型手持数字糖度计 日本爱拓公司；GC9790II型气相色谱仪 浙江福立分析仪器有限公司；HWF-1型红外线分析仪 江苏金坛科析仪器有限公司；TQ-8040型气相色谱-质谱联用仪、SH-Rxi-5Sil MS型毛细管柱日本岛津公司；65 μm PDMS/DVB固相微萃取柱美国Suplco公司；ABI 7500型定量PCR仪 美国Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 硬度及SSC测定

于果实赤道部位去果皮后采用硬度计测定硬度（单位为kg/cm）；采用手持数字糖度计测定SSC。

1.3.2 呼吸速率和乙烯释放速率测定

每20 个果实置容器中密封，于密封30 min时抽取混匀气体10 mL采用红外线分析仪测定密闭气体中CO质量，按公式（1）计算呼吸速率；于密封3 h时抽取混匀气体1 mL注入气相色谱仪测定乙烯体积，按公式（2）计算乙烯释放速率。

1.3.3 VOCs测定

样品制备：参考Chen Jiluan等方法，准确称取适量果皮或果肉粉末冻样于15 mL顶空瓶中，加入一定体积的饱和氯化钠溶液，加入0.2 mL质量浓度1 μg/mL 2-辛酮溶液作为内标溶液，于40 ℃水浴中磁力搅拌30 min，经固相微萃取柱吸附30 min，采用气相色谱-质谱联用仪测定VOCs。

固相微萃取条件：固相微萃取头活化时间7 min，孵育温度40 ℃，孵育时间30 min，吸附时间30 min，解吸时间1 min。

气相色谱条件：SH-Rxi-5Sil MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：40 ℃保持1 min，2 ℃/min升温至100 ℃（保持2 min），4 ℃/min升温至250 ℃（保持5 min），进样口温度250 ℃，载气：高纯氦气，柱流量1 mL/min，不分流进样。

质谱条件：电子电离离子源，离子源温度200 ℃，碰撞能量70 eV，接口温度250 ℃，溶剂延迟时间3 min，工作模式Scan，扫描范围/35～500，通过匹配NIST 17.0质谱数据库及保留指数进行定性，采用内标法计算各成分的含量。

1.3.4 RNA提取与定量分析

采用改良的十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取总RNA。总RNA经DNase清除DNA后，用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒进行反转录，按照定量PCR反应试剂盒TB Green™ Premix ExII说明书进行定量分析。设计基因及其引物序列见表1，所有引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以为内参基因，通过2法计算待测基因相对表达量。

表1 定量PCR引物序列[20-24]Table 1 Primer sequences used for real-time PCR[20-24]

续表1

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2019软件对采集数据进行计算，结果以平均值表示；采用SPSS 20.0统计软件进行组间Duncan’s检验，比较差异显着性。采用HemI 1.0（Heatmap Illustrator）软件绘制热图。

2 结果与分析

2.1 ‘香水’梨贮藏过程中的品质变化

贮藏过程中，‘香水’梨硬度逐渐降低、SSC逐渐升高。相对来说，CK组变化明显，1-MCP处理组的变化较为缓慢，显着抑制了硬度降低和SSC升高（＜0.05）（图1）。

图1 ‘香水’梨果实硬度（A）和SSC（B）变化Fig. 1 Changes in firmness (A) and SSC (B) of ‘Xiangshui’ pear

2.2 ‘香水’梨贮藏过程中的呼吸速率和乙烯释放速率变化

贮藏过程中，CK组果实的呼吸速率呈先升高后降低趋势，其峰值出现在第6天，1-MCP组果实的呼吸速率与相同贮藏时间的CK组相比显着降低（＜0.05），且呈先降低后升高趋势。同样的，CK组果实的乙烯释放速率在9 d出现峰值，之后明显降低，而1-MCP组则缓慢升高，且同期显着低于CK组（＜0.05）（图2）。

图2 ‘香水’梨果实呼吸速率（A）和乙烯释放速率（B）变化Fig. 2 Changes in respiration rate (A) and ethylene production rate (B) of‘Xiangshui’ pear

2.3 ‘香水’梨贮藏过程中的VOCs种类及含量变化

利用固相微萃取-气相色谱-质谱法从香水梨果皮和果肉中共分离鉴定出80 种VOCs，其中酯类48 种、醛类8 种、烷类8 种、醇类7 种、萜烯类6 种、酮类2 种及酚类1 种（表2）。果皮中VOCs数量和总含量明显高于果肉，1-MCP组明显低于CK组（图3）。

图3 ‘香水’梨果皮和果肉中不同种类VOCs含量变化Fig. 3 Changes in contents of VOCs in ‘Xiangshui’ pear

果皮中检出72 种VOCs，主要是酯类、醛类和-法尼烯，醇类和烷类含量次之（表2）。不同贮藏时间果皮中VOCs总量表现为CK组6 d＞12 d＞0 d、1-MCP组12 d＞0 d＞6 d（图3）。由表2可知，酯类以乙酯、己酯为主，其次是甲酯和丁酯，其中己酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、己酸己酯、丁酸己酯的含量依次降低，己酸甲酯、辛酸甲酯、乙酸丁酯和()-2-辛烯酸乙酯含量较少。两组果实果皮中醛类总量均随贮藏期延长而逐渐降低，其中约80%是()-2-己烯醛、其次为己醛和壬醛，其他醛类成分含量很少。醇类主要是辛醇和己醇。十一烷、十六烷和十四烷是主要的烷类成分，前者在两组果皮中含量呈递减趋势，后两者均呈递增趋势。CK组果皮中萜烯总量及各成分含量均随贮藏期延长逐渐升高，1-MCP组则先降低后升高，-法尼烯是最主要的萜烯成分，()-金合欢烯和()--香柠檬醇含量较少。酮类含量极少，主要是6-甲基-5-庚烯-2-酮，其在果皮中的含量也随贮藏期延长先增加后减少。1-MCP明显降低了果皮中-法尼烯和6-甲基-5-庚烯-2-酮含量。

果肉中共检出56 种VOCs，主要是酯类、萜烯、醇类、醛类、烷类，其含量相对低于果皮（表2）。与果皮类似，不同贮藏期果肉中VOCs总量表现为CK组6 d＞12 d＞0 d、1-MCP组12 d＞6 d＞0 d（图3）。酯类是果肉中的主要VOCs，其含量变化规律与VOCs总量一致。由表2可知，己酯类和乙酯类是主要酯类，己酸乙酯和乙酸己酯是主要成分，其后依次是丁酸乙酯、辛酸乙酯、(Z,)-2,4-癸二烯酸甲酯、己酸甲酯、乙酸辛酯、乙酸丁酯等。-法尼烯含量占萜烯总量的90%以上，CK组和1-MCP组果肉中-法尼烯含量均随贮藏期延长而递增，1-MCP组明显低于CK组。果肉中醇类含量较低，主要是辛醇和少量癸醇、己醇。果肉中醛类总量随贮藏期延长递减，各成分含量均很低，其中己醛和()-2-己烯醛仅在0 d果肉中检出，6、12 d未检出。CK组果肉中烷类含量随贮藏期延长递减，而1-MCP组则先增加后减少，其中癸烷仅在0 d检出，6、12 d未检出，十一烷在0 d时未检出而在6、12 d检出（表2）。

由表2可知，随贮藏期的延长，CK组果皮中己醛含量逐渐降低，而1-MCP组果皮中己醛含量一直保持较高水平；两组果皮中()-2-己烯醛含量均逐渐减少。1-MCP组果皮中己醇含量的减少趋势得到抑制，而辛醇含量明显下降，()-4-癸烯醇和癸醇未检出。与对‘南国’梨的研究结果一致，1-MCP显着抑制了‘香水’梨中酯类成分的生成。1-MCP组果皮中酯类成分比CK组少12 种，主要成分乙酸己酯、丁酸己酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、己酸甲酯、丁酸乙酯、己酸己酯、乙酸庚酯、乙酸丁酯、2-辛烯酸甲酯、(,)-2,4-癸二烯酸乙酯和3-(甲硫基)丙酸乙酯的含量显着降低甚至消失。

表2 ‘香水’梨果皮和果肉中VOCs含量Table 2 Contents of VOCs in peel and flesh of ‘Xiangshui’ pears μg/kg

续表2 μg/kg

2.4 ‘香水’梨贮藏过程中相关基因表达的PCR定量结果

贮藏过程中，乙烯合成基因和的表达量在两组果皮中呈上调趋势，在1-MCP组果肉中也呈上调趋势，在CK组果肉中先升后降，且1-MCP组明显低于CK组（图4），其变化规律与乙烯释放速率基本一致，说明1-MCP可以显着抑制乙烯合成基因的表达，进而抑制乙烯生成。存在于内质网上的乙烯受体基因/、/对乙烯的响应最快，其中，在1-MCP组果皮和果肉中的表达量远低于CK组果皮和果肉；贮藏0 d时，/在1-MCP组果皮和果肉中的表达量远低于CK组，随贮藏期延长两组间差异缩小甚至消失；在1-MCP组果皮中的表达量明显低于CK组，在果肉中的表达整体来看1-MCP组和CK组相当；综合分析，1-MCP对乙烯受体相关基因/、/的表达具有抑制作用。乙烯信号转导因子的表达，在CK组果皮和果肉中均呈先升后降趋势，在1-MCP组果皮和果肉中均逐渐升高，1-MCP组果肉明显低于CK组，贮藏6 d时1-MCP组果皮低于CK组；乙烯响应因子基因的表达量，在CK组果皮和果肉中均呈逐渐降低趋势，在1-MCP组果皮和果肉中却逐渐升高，贮藏0 d和6 d时1-MCP组果皮明显低于CK组，贮藏12 d时1-MCP组果皮反而高于CK组；这表明1-MCP对乙烯信号转导具有抑制和延迟变化的作用。

贮藏过程中，CK组果皮和果肉中、、表达量均呈先升后降趋势，1-MCP组果皮和果肉中、、表达量均呈上升趋势（图4），且1-MCP组明显低于CK组，此规律与VOCs总量变化规律一致，说明1-MCP可以抑制//基因表达，从而抑制脂肪酸转化为VOCs。1-MCP组和CK组果皮、果肉中和基因的表达量均呈下调趋势，且1-MCP组表达量整体上明显高于CK组，说明1-MCP明显抑制这种下调趋势；相对来说，果皮、的表达量高于果肉（图4）。CK组果皮和果肉中表达量在贮藏6 d时达到高峰，1-MCP整体上明显下调了表达，1-MCP组果皮表达量明显低于CK组，1-MCP组果肉表达量在贮藏0 d和6 d时低于CK组，贮藏至12 d时则高于CK组，果皮中表达量明显高于果肉（图4）。

图4 1-MCP对‘香水’梨乙烯生成及其信号转导、VOCs生成相关基因表达的影响Fig. 4 Effect of 1-MCP on the expression of genes associated with ethylene biosynthesis and signal transduction, VOCs synthesis in‘Xiangshui’ pears

2.5 ‘香水’梨贮藏过程中相关基因表达量之间的相关性

经相关性分析，香气合成相关基因与乙烯合成及信号转导相关基因表达量之间存在一定的相关性（表3）。脂氧合酶相关基因、表达量均与乙烯合成相关基因、表达量及乙烯受体基因表达量呈极显着正相关（＜0.01），表达量与乙烯信号转导基因表达量呈极显着正相关（＜0.01），酯类合成直接相关基因与乙烯信号转导基因表达量显着正相关（＜0.05）、与表达量呈极显着正相关（＜0.01）。醇合成相关基因、表达量则与、表达量呈极显着负相关（＜0.01），表达量还与和表达量显着负相关（＜0.05）。香气合成各基因之间，表达量与和表达量均呈显着正相关（＜0.05、＜0.01），表达量与、表达量呈显着负相关（＜0.05），表达量与表达量呈显着负相关（＜0.05）。这说明上述基因表达的变化影响了‘香水’梨贮藏期内的香气合成。

表3 ‘香水’梨乙烯生成及其信号转导、VOCs合成相关基因表达量间相关性分析Table 3 Correlation analysis of expression levels of genes related to ethylene biosynthesis and signal transduction, and VOCs synthesis in ‘Xiangshui’ pears

3 讨 论

秋子梨在采后贮藏过程中会发生一系列的生理变化而后熟，果实逐渐变得柔软多汁、香味浓郁，食用性变好。果实的后熟与乙烯密切相关，一方面果实在后熟过程中会释放大量乙烯，另一方面乙烯可以促进果实成熟。1-MCP可以与乙烯受体不可逆结合，阻止乙烯受体与乙烯的结合，进而抑制乙烯信号的转导和乙烯的产生达到保鲜目的，但新生成的乙烯受体不与1-MCP结合，会逐渐弱化1-MCP的保鲜作用。本实验的研究结果与此一致，与CK组相比，1-MCP处理组‘香水’梨果实的乙烯生成速率显着降低（图2），果实硬度和SSC变化得到显着抑制（＜0.05）（图1），乙烯合成酶相关基因和的表达量明显下调（图4），乙烯信号转导相关基因/、/、和的表达量均被下调（图4）；各项生理指标、品质指标及相关基因的变化被抑制和延缓。

香气是果实的重要表观品质，采后贮藏中，秋子梨的香气品质随后熟逐渐浓郁、芳香，随水果衰老、腐败又逐渐变淡。果实VOCs合成路径中某些关键酶及其基因表达受乙烯调控，外源乙烯量的增加可以促进果实VOCs生成，采用1-MCP进行保鲜处理会减少果实中芳香类成分的生成量。本研究结果显示，CK组‘香水’梨果皮、果肉中的VOCs种类和总含量均为贮藏6 d时最高，1-MCP组果肉中的VOCs种类和含量在贮藏过程中逐渐增加，果皮中VOCs种类和总含量贮藏6 d时最少，组间同期比较1-MCP组少于CK组（图3、表2）；这与两组果皮、果肉中的脂氧合酶//相关基因表达量的变化情况（图4）一致。此外，酯类合成直接相关基因表达量与乙烯信号转导基因表达量显着正相关（＜0.05）、与乙烯受体基因表达量呈极显着正相关（＜0.01），醇合成相关基因表达量与乙烯合成相关基因、表达量极显着负相关（＜0.01），与乙烯信号转导相关基因、表达量显着负相关（＜0.05），表达量与乙烯合成相关基因、表达量极显着负相关（＜0.01），说明乙烯信号系统通过调控果实VOCs合成相关基因表达，影响果实VOCs的合成。

4 结 论

‘香水’梨采后贮藏过程中果实逐渐软化、SSC增加，VOCs的种类和含量逐渐增加，1-MCP处理有利于维持‘香水’梨果实贮藏中的硬度和SSC，抑制果皮和果肉中VOCs合成。1-MCP可通过下调‘香水’梨果皮、果肉中的乙烯生成限速酶相关基因和、乙烯信号转导相关基因、/和的表达，降低脂氧合酶//及醇酰基转移酶基因的表达量，抑制‘香水’梨采后品质变化和VOCs生成。